Kea leboha ha le etetse Nature.com. Mofuta wa sebatli seo o se sebedisang o na le tshehetso e fokolang ya CSS. Bakeng sa diphetho tse ntle ka ho fetisisa, re kgothaletsa hore o sebedise mofuta o motjha wa sebatli sa hao (kapa o tima Mokgwa wa ho Kopana ho Internet Explorer). Ho sa le jwalo, ho netefatsa tshehetso e tswelang pele, re bontsha sebaka sena sa marang-rang ntle le setaele kapa JavaScript.
Ho sibolloa le tšebeliso e molemo ea lihlahisoa tsa tlhaho ho ka thusa ho ntlafatsa bophelo ba batho. Lik'hemik'hale tse thibelang kholo ea limela li sebelisoa haholo e le li-herbicide ho laola mofoka. Ka lebaka la tlhoko ea ho sebelisa mefuta e fapaneng ea li-herbicide, ho na le tlhoko ea ho khetholla metsoako e nang le mekhoa e mecha ea ts'ebetso. Thutong ena, re sibolotse motsoako o mocha oa N-alkoxypyrrole, coumamonamide, o tsoang ho Streptomyces werraensis MK493-CF1 mme ra theha ts'ebetso e felletseng ea ho kopanya. Ka liteko tsa ts'ebetso ea baeloji, re sibolotse hore urs-monoamic acid ke motsoako oa maiketsetso oa urs-monoamide le monyetla oa ho ba teng.sethibela-kholo sa kholo ea limelaHo phaella moo, re hlahisitse di-derivative tse fapaneng tsa urbenonic acid, ho kenyeletswa le urbenyloxy derivative (UDA), e nang le ts'ebetso e phahameng ya ho bolaya ditlama ntle le ho ama kgolo ya disele tsa HeLa hampe. Re boetse re fumane hore di-derivative tsa urmotonic acid di sitisa di-microtubules tsa dimela; ho feta moo, KAND e ama di-filament tsa actin mme e baka lefu la sele; Ditlamorao tsena tse nang le mahlakore a mangata di fapana le tsa di-microtubule inhibitors tse tsejwang mme di fana ka maikutlo a mokgwa o motjha wa tshebetso bakeng sa ursonic acid, e leng monyetla wa bohlokwa ntshetsopeleng ya dibolaya-ditlama tse ntjha.
Ho sibolloa le ho sebelisoa ha lihlahisoa tsa tlhaho tse molemo le lihlahisoa tsa tsona ke mokhoa oa ho ntlafatsa boleng ba bophelo ba batho. Li-metabolite tsa bobeli tse hlahisoang ke likokoana-hloko, limela le likokoanyana li lebisitse tsoelo-peleng e kholo ea bongaka le temo. Lithibela-mafu tse ngata le meriana e loantšang kankere ea mali li entsoe ka lihlahisoa tsa tlhaho. Ho phaella moo, mefuta e fapaneng eachefo e bolaeang likokoanyana, dibolaya-dikokwana-hloko le dibolaya-dikokwana-hloko di ntshuwa dihlahisweng tsena tsa tlhaho bakeng sa tshebediso temong. Haholo-holo, dibolaya-dikokwana-hloko tsa taolo ya mofoka ke disebediswa tsa bohlokwa bakeng sa ho eketsa chai ya dijalo temong ya sejwalejwale, mme mefuta e fapaneng ya dikokwana-hloko e se e sebediswa kgwebong. Ditshebetso tse mmalwa tsa sele dimeleng, tse kang photosynthesis, metabolism ya amino acid, tlhahiso ya lebota la sele, taolo ya mitosis, phytohormone signaling, kapa tlhahiso ya protheine, di nkuwa e le dipheo tse tlwaelehileng tsa dibolaya-dikokwana-hloko. Dikokwana-hloko tse thibelang tshebetso ya microtubule ke sehlopha se tlwaelehileng sa dibolaya-dikokwana-hloko tse amang kgolo ya dimela ka ho ama taolo ya mitotic2.
Li-microtubules ke likarolo tsa cytoskeleton 'me li bolokiloe haholo liseleng tsa eukaryotic. Heterodimer ea tubulin e na le α-tubulin le β-tubulin tse etsang li-protofilament tsa microtubule tse otlolohileng, tse nang le li-protofilament tse 13 tse etsang sebopeho sa cylindrical. Li-microtubules li bapala mesebetsi e mengata liseleng tsa limela, ho kenyeletsoa ho fumana sebopeho sa sele, karohano ea sele, le lipalangoang tsa ka hare ho sele3,4. Lisele tsa limela li na le li-microtubules ka tlas'a lera la plasma la interphase, 'me li-microtubules tsena tse bitsoang cortical ho nahanoa hore li laola ho hlophisoa ha li-microfibrils tsa cellulose ka ho laola li-complexes tsa cellulose synthase4,5. Li-microtubules tsa cortical tsa lisele tsa epidermal tsa metso, tse teng sebakeng sa ho hola ka potlako ha ntlha ea motso, li fumaneha ka lehlakoreng, 'me li-microfiber tsa cellulose li latela li-microtubules tsena 'me li fokotsa tataiso ea katoloso ea sele, ka hona li khothalletsa ho hola ha sele ea anisotropic. Ka hona, mosebetsi oa microtubule o amana haufi-ufi le sebopeho sa semela. Ho nkeloa sebaka ha amino acid liphatseng tsa lefutso tse kenyang tubulin ho baka ho sekama ha li-array tsa cortical microtubule le kholo ea lehlakoreng le letšehali kapa le letona ho Arabidopsis 6,7. Ka mokhoa o ts'oanang, liphetoho liprotheineng tse amanang le microtubule tse laolang matla a microtubule le tsona li ka lebisa kholong e sothehileng ea metso8,9,10,11,12,13. Ho phaella moo, kalafo ka li-herbicides tse sitisang microtubule tse kang disopyramide, tse tsejoang hape e le pretilachlor, le tsona li baka kholo ea metso e oblique ea lehlakore le letšehali14. Lintlha tsena li bontša hore taolo e nepahetseng ea ts'ebetso ea microtubule e bohlokoa bakeng sa ho fumana tataiso ea kholo ea limela.
Mefuta e fapaneng ea lithibela-mafu tse nyenyane e fumanoe, 'me meriana ena e entse menehelo e kholo lipatlisisong tsa cytoskeletal, hammoho le temong le bongaka2. Haholo-holo, oryzalin, metsoako ea dinitroaniline, disopyramide, metsoako e amanang le benzamide, le li-analogue tsa tsona li ka thibela ts'ebetso ea microtubule 'me ka hona tsa thibela kholo ea limela. Ka hona, li sebelisoa haholo e le li-herbicide. Leha ho le joalo, kaha li-microtubule ke karolo ea bohlokoa ea lisele tsa limela le tsa liphoofolo, boholo ba li-microtubule inhibitors li na le chefo ho mefuta ka bobeli ea lisele. Ka hona, ho sa tsotellehe thuso ea tsona e tsejoang e le li-herbicide, palo e fokolang ea li-antimicrotubule agents li sebelisoa bakeng sa merero e sebetsang.
Streptomyces ke mofuta oa lelapa la Streptomyces, le kenyeletsang libaktheria tse nang le aerobic, gram-positive, filamentous 'me le tsebahala haholo ka bokhoni ba lona ba ho hlahisa mefuta e mengata ea li-metabolite tsa bobeli. Ka hona, e nkoa e le e 'ngoe ea mehloli ea bohlokoa ka ho fetisisa ea lihlahisoa tse ncha tsa tlhaho tse sebetsang ka baeloji. Phuputsong ea hajoale, re sibolotse motsoako o mocha o bitsoang coumamonamide, o neng o arotsoe ho Streptomyces werraensis MK493-CF1 le S. werraensis ISP 5486. Ka ho sebelisa tlhahlobo ea spectral le tlhahlobo e felletseng ea spectral, sebopeho sa coumamonamide se ile sa hlalosoa 'me masapo a eona a ikhethang a N-alkoxypyrrole a ile a fumanoa. Ursmonic acid, e leng motsoako oa maiketsetso oa ursmonoamide le li-derivatives tsa eona, e fumanoe e thibela kholo le ho mela ha semela se tsebahalang sa mohlala Arabidopsis thaliana. Thutong ea kamano ea sebopeho le mosebetsi, re fumane hore motsoako o nang le C9 o fetotsoeng ho ursonic acid, o bitsoang nonyloxy derivative ea ursonic acid (KAND), o ntlafatsa haholo phello ea thibelo kholong le ho mela. Haholo-holo, thibelo e sa tsoa sibolloa ea kholo ea limela e boetse e amme kholo ea koae le liverwort 'me e ne e se chefo ho libaktheria kapa lisele tsa HeLa. Ho feta moo, li-derivative tse ling tsa urmotonic acid li baka phenotype e sothehileng ea motso, e leng se bolelang hore li-derivative tsena li ama li-microtubules ka kotloloho kapa ka tsela e sa tobang. Tumellanong le mohopolo ona, lintho tseo re li boneng ka li-microtubules tse ngotsoeng ka immunohistochemically kapa ka liprotheine tse khanyang li bontša hore kalafo ea KAND e fokotsa li-microtubules. Ho phaella moo, kalafo ka li-derivatives tsa kumamotonic acid e sitisitse li-microfilaments tsa actin. Kahoo, re sibolotse thibelo e ncha ea kholo ea limela eo mokhoa oa eona o ikhethang oa ts'ebetso o kenyelletsang ho timetsoa ha cytoskeleton.
Mofuta oa MK493-CF1 o ile oa aroloa mobung Shinagawa-ku, Tokyo. Mofuta oa MK493-CF1 o ile oa theha mycelium e nang le makala a matle. Tatellano e sa fellang ea gene ea 16S ribosomal RNA (1422 bp) e ile ea fumanoa. Mofuta ona o tšoana haholo le S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: mofuta o tloaelehileng, 99.93%). Ho latela sephetho sena, ho ile ha fumanoa hore mofuta ona o amana haufi-ufi le mofuta oa mofuta oa S. werraensis. Ka hona, re ile ra reha mofuta ona S. werraensis MK493-CF1 ka nakoana. S. werraensis ISP 5486T le eona e hlahisa metsoako e tšoanang ea bioactive. Kaha ho bile le lipatlisiso tse nyane tsa pele mabapi le ho fumana lihlahisoa tsa tlhaho ho tsoa ho microorganism ena, ho ile ha etsoa lipatlisiso tse ling tsa lik'hemik'hale. Kamora ho lema S. werraensis MK493-CF1 holim'a harese ka ho belisoa ka solid-state ho 30°C ka matsatsi a 14, sejana se ile sa ntšoa ka 50% EtOH. 60 ml ea sampole e ile ea omisoa ho fumana 59.5 mg ea sejana se se nang mafura. Sejana se se nang mafura se ile sa kenngoa HPLC ea reverse phase ho fana ka N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, e bitsoang coumamonamide, 36.0 mg). Kakaretso ea 1 ke hoo e ka bang 60% ea sejana se se nang mafura. Ka hona, re nkile qeto ea ho ithuta ka botlalo thepa ea kumamotoamide 1.
Coumamonamide 1 ke phofo e tšoeu e sa fetoheng le spectrometry ea boima bo phahameng (HRESIMS) e tiisa C6H8N2O2 (Setšoantšo sa 1). Karolo ea pyrrole e nkeloang sebaka ke C2 ea motsoako ona e khetholloa ka δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH ho spectrum ea 1H NMR: 4.5 Hz, H-5) le δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), 'me spectrum ea 13C NMR e bontša boteng ba liathomo tse 'ne tsa carbon tsa sp2. Boteng ba sehlopha sa amide boemong ba C2 bo ile ba hlahlojoa ke kamano ea HMBC ho tloha ho proton ea C-3 ho ea ho amide carbonyl carbon ho δC 161.1. Ho phaella moo, 1 H le 13 C NMR tlhōrō ho δH 4.10 (3H, S) le δC 68.3 li bontša boteng ba lihlopha tsa N-methoxy ka har'a molek'hule. Leha boemo bo nepahetseng ba sehlopha sa methoxy bo ne bo e-so fumanoe ka ho sebelisa tlhahlobo ea spectroscopic joalo ka enhanced difference spectroscopy le nuclear Overhauser abbreviation (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide e bile motsoako oa pele o ka khethoang.
Ho fumana sebopeho se nepahetseng sa 1, ho entsoe tlhahiso e felletseng (Setšoantšo sa 2a). Kalafo ea 2-aminopyridine 2 e fumanehang khoebong ka m-CPBA e hlahisitse N-oxide 3 e tsamaellanang le eona ka chai ea bongata. Kamora 2-aminoazidation ea 2, karabelo ea cyclocondensation e hlalositsoeng ke Abramovich e entsoe ka benzene ka 90°C ho fumana 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 ka ligrama. Lebelo 60% (mekhahlelo e 'meli). 15,16. Methylation le hydrolysis ea 4 li ile tsa fana ka 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (e bitsoang "cumotonic acid", 6) ka chai e ntle (70%, mehato e 'meli). Qetellong, amidation ka acid chloride intermediate 6 ho sebelisoa ammonia ea metsi e file Kumamoto amide 1 ka chai ea 98%. Lintlha tsohle tsa spectral tsa 1 e entsoeng li ne li tšoana le 1 e arohaneng, kahoo sebopeho sa 1 se ile sa fumanoa;
Ho kopanya le ho sekaseka ka kakaretso mosebetsi oa baeloji oa urbenamide le urbenic acid. (a) Ho kopanya ka botlalo Kumamoto amide. (b) Lipeo tsa Arabidopsis Columbia (Col) tsa mofuta oa naha tse nang le matsatsi a supileng li holisitsoe lipoleiting tsa Murashige le Skoog (MS) tse nang le coumamonamide 6 kapa coumamonamide 1 maemong a bontšitsoeng. Sekala sa tekanyo = 1 cm.
Taba ea pele, re ile ra hlahloba mesebetsi ea baeloji ea urbenamide le metsoako ea eona e bohareng bakeng sa bokhoni ba eona ba ho fetola kholo ea limela. Re ekelitse mahloriso a fapaneng a ursmonamide 1 kapa ursmonic acid 6 ho MS agar medium le lipeo tsa Arabidopsis thaliana tse lengoang mecheng ena. Liteko tsena li bontšitse hore mahloriso a phahameng (500 μM) a 6 a sitisitse kholo ea metso (Setšoantšo sa 2b). Ka mor'a moo, re hlahisitse li-derivatives tse fapaneng ka ho nkela boemo ba N1 ba 6 sebaka 'me ra etsa lithuto tsa kamano ea sebopeho le mosebetsi ho tsona (ts'ebetso ea ho kopanya analoge e hlalositsoe ho Tšehetso ea Tlhahisoleseling (SI)). Lipeo tsa Arabidopsis li holisitsoe mecheng e nang le li-derivatives tsa ursonic acid tsa 50 μM, 'me bolelele ba metso bo ile ba lekanngoa. joalo ka ha bo bontšitsoe setšoantšong. Jwalo ka ha ho bontshitswe ho Ditshwantsho tsa 3a, b, le S1, di-coumamo acid di na le bolelele bo fapaneng ba diketane tsa alkoxy tse otlolohileng (9, 10, 11, 12, le 13) kapa diketane tse kgolo tsa alkoxy (15, 16, le 17) boemong ba N1. Di-derivatives di bontshitse thibelo e kgolo ya kgolo ya metso. Ho phaella moo, re fumane hore tshebediso ya 200 μM 10, 11, kapa 17 e thibetse ho mela ha metso (Ditshwantsho tsa 3c le S2).
Thuto ea kamano ea sebopeho le mosebetsi oa Kumamoto amide le metsoako e amanang le eona. (a) Sebopeho le moralo oa motsoako oa li-analogue. (b) Tekanyo ea bolelele ba metso ea lipeo tsa matsatsi a 7 tse holisitsoeng ho MS medium ka kapa ntle le li-derivatives tsa coumamonamide tsa 50 μM. Li-asterisk li bontša liphapang tse kholo ka kalafo ea bohata (t test, p< 0.05). n>18. Lintlha li bontšoa e le karolelano ea ± SD. nt e bolela "ha ea lekoa" hobane peo e fetang 50% ha ea ka ea mela. (c) Tekanyo ea sekhahla sa ho mela ha peo e phekoloang e bolokiloeng matsatsi a 7 sebakeng sa MS se nang le kapa se se nang coumamonamide ea 200 μM le metsoako e amanang le eona. Li-asterisk li bontša liphapang tse kholo ka kalafo ea bohata (teko ea chi-square). n=96.
Hoa thahasellisa hore ho eketsoa ha liketane tsa lehlakore la alkyl tse telele ho feta C9 ho fokolitse ts'ebetso ea thibelo, ho fana ka maikutlo a hore metsoako e amanang le kumamotoic acid e hloka liketane tsa lehlakore tsa boholo bo itseng ho bontša ts'ebetso ea tsona ea baeloji.
Hobane tlhahlobo ea kamano ea sebopeho le mosebetsi e bontšitse hore C9 e fetotsoe ho ba ursonic acid 'me nonyloxy derivative ea ursonic acid (eo ho thoeng ke KAND 11) e ne e le thibelo e sebetsang ka ho fetisisa ea kholo ea limela, re entse tlhaloso e qaqileng haholoanyane ea KAND 11. Kalafo ea Arabidopsis ka 50 μM KAND 11 e batla e thibetse ho mela ha metso ka botlalo, athe mahloriso a tlase (40, 30, 20, kapa 10 μM) a KAND 11 a thibetse kholo ea metso ka mokhoa o itšetlehileng ka tekanyo (Setšoantšo sa 4a, b). Ho leka hore na KAND 11 e ama ho phela ha metso ea metso, re hlahlobile meristems ea metso e daelitsoeng ka propidium iodide (PI) 'me ra lekanya boholo ba sebaka sa meristem. Boholo ba meristem ea lipeo tse holisitsoeng holim'a sehare se nang le 25 μM KAND-11 e ne e le 151.1 ± 32.5 μm, ha boholo ba meristem ea lipeo tse holisitsoeng holim'a sehare se nang le DMSO e ne e le 264.7 ± 30.8 μm (Setšoantšo sa 4c, d), e leng se bontšang hore KAND-11 e tsosolosa ts'ebetso ea sele. ho ata. Meristem ea metso. Tumellanong le sena, kalafo ea KAND 11 e fokolitse palo ea letšoao la karohano ea sele CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS mothating oa metso (Setšoantšo sa 4e) 17. Liphetho tsena li bontša hore KAND 11 e thibela kholo ea metso ka ho fokotsa ts'ebetso ea ho ata ha sele.
Tlhahlobo ea phello ea thibelo ea li-derivatives tsa urbenonic acid (li-derivatives tsa urbenyloxy) kholong. (a) Lipeo tsa mofuta oa tlhaho tsa Col tse nang le matsatsi a 7 tse holisitsoeng lipoleiting tsa MS ka mahloriso a bontšitsoeng a KAND 11. Sekala sa bareng = 1 cm. (b) Palo ea bolelele ba motso. Litlhaku li bontša liphapang tse kholo (Teko ea Tukey HSD, p.< 0.05). n>16. Lintlha li bontšoa e le karolelano ea ± SD. (c) Microscopy ea Confocal ea metso ea mofuta oa Col e nang le matheba a propidium iodide e holisitsoeng lipoleiting tsa MS tse nang le kapa tse se nang 25 μM KAND 11. Li-bracket tse tšoeu li bontša motso oa meristem. Sekala sa bar = 100 µm. (d) Palo ea boholo ba motso oa meristem (n = 10 ho isa ho 11). Liphapang tsa lipalo-palo li fumanoe ho sebelisoa teko ea t (p).< 0.05). Mebala e emela boholo bo tloaelehileng ba meristem. (e) Microscopy ea phapang ea phapang ea phapang (DIC) ea motso oa meristem o nang le sebopeho sa CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS e silafalitsoe le ho silafatsoa lipeong tsa matsatsi a 5 tse holisitsoeng lipoleiting tsa MS ka kapa ntle le teko ea KAND ea 25 µM.
Chefo ea KAND 11 e ile ea lekoa hape ka ho sebelisa semela se seng se nang le dicotyledonous, koae (Nicotiana tabacum), le sebopuoa se seholo sa mohlala oa limela tsa naha, liverwort (Marchantia polymorpha). Joalo ka tabeng ea Arabidopsis, lipeo tsa koae tsa SR-1 tse holisitsoeng sebakeng se mahareng se nang le 25 μM KAND 11 li hlahisitse metso e mekhutšoanyane (Setšoantšo sa 5a). Ho phaella moo, peo tse 40 ho tse 48 li ile tsa mela lipoleiting tse nang le 200 μM KAND 11, athe peo tsohle tse 48 li ile tsa mela mecheng e tšoeroeng ka mokhoa oa ho iketsa, ho bontšang hore maemo a holimo a KAND a ne a le bohlokoa (p).< 0.05; teko ea chi -square) e thibetse ho mela ha koae. (Setšoantšo sa 5b). Ho phaella moo, khatello ea KAND 11 e thibetseng kholo ea baktheria ho liverwort e ne e tšoana le khatello e sebetsang ho Arabidopsis (Setšoantšo sa 5c). Liphetho tsena li bontša hore KAND 11 e ka thibela kholo ea limela tse fapaneng. Eaba re batlisisa chefo e ka bang teng ea metsoako e amanang le bear monoamide linthong tse ling tse phelang, e leng lisele tsa HeLa tsa batho le mofuta oa Escherichia coli DH5α, e le baemeli ba lisele tse phahameng tsa liphoofolo le tsa baktheria, ka ho latellana. Letotong la liteko tsa ho ata ha lisele, re hlokometse hore coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6, le KAND 11 ha lia ka tsa ama kholo ea lisele tsa HeLa kapa E. coli maemong a 100 μM (Setšoantšo sa 5d,e).
Thibelo ea kholo ea KAND 11 linthong tse phelang tse seng tsa Arabidopsis. (a) Lipeo tsa koae tsa mofuta oa SR-1 tsa mofuta oa naha tse libeke tse peli li holisitsoe lipoleiting tsa MS tse behiloeng ka ho otloloha tse nang le 25 μM KAND 11. (b) Lipeo tsa koae tsa mofuta oa SR-1 tsa mofuta oa naha tse libeke tse peli li holisitsoe lipoleiting tsa MS tse behiloeng ka ho otloloha tse nang le 200 μM KAND 11. (c) Li-buds tsa mofuta oa Tak-1 tsa mofuta oa naha tse libeke tse peli tse holisitsoeng lipoleiting tsa Gamborg B5 ka mahloriso a bontšitsoeng a KAND 11. Metsu e khubelu e bontša li-spores tse ileng tsa emisa ho hola nakong ea libeke tse peli tsa ho hola. (d) Teko ea ho ata ha lisele tsa HeLa. Palo ea lisele tse phelang e ile ea lekanngoa ka linako tse behiloeng ho sebelisoa kit ea ho bala lisele 8 (Dojindo). E le taolo, lisele tsa HeLa li ile tsa phekoloa ka 5 μg/ml actinomycin D (Act D), e thibelang phetolelo ea RNA polymerase le ho baka lefu la sele. Litlhahlobo li entsoe ka makhetlo a mararo. (e) Teko ea ho ata ha lisele tsa E. coli. Kgolo ya E. coli e hlahlobilwe ka ho lekanya OD600. E le taolo, disele di ile tsa phekolwa ka 50 μg/ml ampicillin (Amp), e thibelang tlhahiso ya lebota la sele ya baktheria. Ditlhahlobo di entswe ka hararo.
Ho fumana mokhoa oa ts'ebetso ea chefo ea cytotoxicity e bakoang ke metsoako e amanang le uramide, re hlahlobile hape li-derivatives tsa urbenic acid ka litlamorao tse itekanetseng tsa thibelo. joalo ka ha ho bontšitsoe setšoantšong. Joalokaha ho bontšitsoe ho Setšoantšo sa 2b, 6a, lipeo tse holisitsoeng lipoleiting tsa agar tse nang le likhakanyo tse phahameng (200 μM) tsa urmotonic acid 6 li hlahisitse metso e mekhutšoanyane le e kobehileng ka letsohong le letšehali (θ = – 23.7 ± 6.1), athe lipeo tse holisitsoeng setsing sa taolo, lipeo li hlahisitse metso e batlang e otlolohile (θ = – 3.8 ± 7.1). Kholo ena e ikhethang ea oblique e tsejoa e bakoa ke ho se sebetse hantle ha li-microtubules tsa cortical14,18. Tumellanong le se fumanoeng sena, meriana e fokotsang botsitso ea microtubule disopyramide le oryzalin e bakile ho sekama ho tšoanang ha metso tlas'a maemo a rona a kholo (Setšoantšo sa 2b, 6a). Ka nako e ts'oanang, re lekile li-derivatives tsa urmotonic acid 'me ra khetha tse' maloa tsa tsona tse, ka likhakanyo tse itseng, li bakileng kholo ea metso e oblique. Metswako ya 8, 9, le 15 e fetotse tsela eo metso e holang ka yona ho 75 μM, 50 μM, le 40 μM, ka ho latellana, e leng se bontshang hore metsoako ena e ka sitisa di-microtubules ka katleho (Setshwantsho sa 2b, 6a). Re boetse ra leka setswakwa se matla ka ho fetisisa sa ursolic acid, KAND 11, ka tekanyo e tlase (15 µM) mme ra fumana hore tshebediso ya KAND 11 e sitisa kgolo ya metso le hore tsela eo metso e holang ka yona e ne e sa lekana, le hoja e ne e sekametse ho thella ka letsohong le letshehadi (Setshwantsho sa C3). . Hobane maemo a hodimo a meriana e sitisang di-microtubule ka dinako tse ding a sitisa kgolo ya dimela ho ena le ho baka ho sekama ha metso, re ile ra hlahloba monyetla wa hore KAND 11 e ama di-microtubule ka ho shebella di-microtubule tsa cortical diseleng tsa epidermal tsa metso. Immunohistochemistry e sebedisang di-antibodies tsa anti-β-tubulin diseleng tsa epidermal tsa metso ya dipeo e phekotsweng ka 25 μM KAND 11 e bontshitse ho nyamela ha di-microtubule tse ka bang tsohle tsa cortical diseleng tsa epidermal sebakeng sa ho lelefatsa (Setshwantsho sa 6b). Liphetho tsena li bontša hore kumamotonic acid le lintho tse tsoang ho eona li sebetsa ka kotloloho kapa ka tsela e sa tobang holim'a li-microtubules ho li sitisa le hore metsoako ena ke lithibela-mafu tse ncha tsa microtubule.
Asiti ea Ursonic le lintho tse tsoang ho eona li fetola li-microtubules tsa cortical ho Arabidopsis thaliana. (a) Sekhutlo sa ho sekamela ha motso se lekantsoe boteng ba li-derivatives tse fapaneng tsa urmotonic acid maemong a bontšitsoeng. Litlamorao tsa metsoako e 'meli e tsejoang ka ho thibela li-microtubules: disopyramide le oryzalin le tsona li ile tsa hlahlojoa. Karolo e ka hare e bontša maemo a sebelisoang ho lekanya sekhutlo sa kholo ea motso. Li-asterisk li bontša liphapang tse kholo ka kalafo ea bohata (teko ea t, p< 0.05). n>19. Sekala sa tekanyo = 1 cm. (b) Li-microtubule tsa cortical liseleng tsa epidermal sebakeng sa ho lelefatsa. Li-microtubule metsong ea Arabidopsis Col ea mofuta oa tlhaho e holisitsoeng lipoleiting tsa MS tse nang le kapa tse se nang 25 μM KAND 11 li ile tsa bonoa ka ho taka ha immunohistochemical ho sebelisoa li-antibodies tsa mantlha tsa β-tubulin le li-antibodies tsa bobeli tsa Alexa Fluor-conjugated. Sekala sa tekanyo = 10 µm. (c) Sebopeho sa mitotic sa li-microtubule motsong oa motso. Li-microtubule li ile tsa bonoa ka ho sebelisa ho taka ha immunohistochemical. Meaho ea mitotic, ho kenyeletsoa libaka tsa prophase, li-spindle, le li-phragmoplast, e baliloe ho tsoa litšoantšong tsa confocal. Metsu e bontša meaho ea mitotic microtubule. Li-asterisk li bontša liphapang tse kholo ka kalafo ea sham (teko ea t, p< 0.05). n>9. Sekala sa bareng = 50 µm.
Leha Ursa e na le bokgoni ba ho sitisa tshebetso ya microtubule, mokgwa wa yona wa tshebetso o lebelletswe ho fapana le di-agent tse tlwaelehileng tsa microtubule depolymerizing. Mohlala, maemo a hodimo a di-agent tsa microtubule depolymerizing tse kang disopyramide le oryzalin a baka katoloso ya anisotropic ya disele tsa epidermal, athe KAND 11 ha e etse jwalo. Ho phaella moo, tshebediso mmoho ya KAND 11 le disopyramide e bakile karabelo e kopaneng ya kgolo ya metso e bakwang ke disopyramide mme thibelo ya kgolo e bakwang ke KAND 11 e bontshitswe (Setshwantsho sa S4). Re boetse ra sekaseka karabelo ya mutant e nang le hypersensitivity disopyramide 1-1 (phs1-1) ho KAND 11. phs1-1 e na le phetoho ya ntlha ya tubulin kinase e seng ya canonical mme e hlahisa metso e mekgutshwane ha e phekolwa ka disopyramide9,20. Dipeo tse fetotsweng tsa phs1-1 tse hodisitsweng hodima agar medium tse nang le KAND 11 di ne di na le metso e mekgutshwane e tshwanang le e hodisitsweng ho disopyramid (setshwantsho sa S5).
Ho phaella moo, re bone dibopeho tsa mitotic microtubule, tse kang dibaka tsa prophase, di-spindle, le di-phragmoplast, motsong wa metso wa dipeo tse phekotsweng ka KAND 11. Ho ya ka seo ho bonweng ka sona bakeng sa CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, ho ile ha bonwa phokotseho e kgolo palong ya di-mitotic microtubules (Setshwantsho sa .6c).
Ho hlalosa chefo ea KAND 11 ka har'a tharollo ea lisele tse ka tlas'a lisele, re ile ra phekola lisele tsa koae tsa BY-2 ka KAND 11 'me ra bona karabelo ea tsona. Re ile ra qala ka ho eketsa KAND 11 ho lisele tsa BY-2 tse hlahisang TagRFP-TUA6, e ngolang li-microtubules ka mokhoa o phatsimang, ho lekola phello ea KAND 11 ho li-microtubules tsa cortical. Bongata ba li-microtubule tsa cortical bo ile ba lekoa ho sebelisoa tlhahlobo ea setšoantšo, e ileng ea lekanya peresente ea li-pixel tsa cytoskeletal har'a li-pixel tsa cytoplasmic. Liphetho tsa tlhahlobo li bontšitse hore kamora kalafo ka 50 μM kapa 100 μM KAND 11 ka hora e le 'ngoe, bongata bo ile ba fokotseha haholo ho ea ho 0.94 ± 0.74% kapa 0.23 ± 0.28%, ka ho latellana, ha bongata ba lisele tse phekoloang ka DMSO, bo ne bo lekana le 1.61 ± 0.34% (Setšoantšo sa 7a). Liphetho tsena li tsamaellana le tlhokomeliso ho Arabidopsis ea hore kalafo ea KAND 11 e baka ho tlosoa ha li-microtubules tsa cortical (Setšoantšo sa 6b). Re boetse ra hlahloba mola oa BY-2 o nang le li-filament tsa actin tse ngotsoeng ka GFP-ABD kamora kalafo ka khatello e tšoanang ea KAND 11 mme ra hlokomela hore kalafo ea KAND 11 e sitisitse li-filament tsa actin. Kalafo ka 50 μM kapa 100 μM KAND 11 ka hora e le 'ngoe e fokolitse haholo bongata ba filament ea actin ho 1.20 ± 0.62% kapa 0.61 ± 0.26%, ka ho latellana, athe bongata ba lisele tse tšoaroang ke DMSO e ne e le 1.69 ± 0.51% (Setšoantšo sa 2). 7b). Liphetho tsena li fapana le liphello tsa propyzamide, e sa ameng li-filament tsa actin, le latrunculin B, depolymerizer ea actin e sa ameng li-microtubules (Setšoantšo sa SI S6). Ho phaella moo, kalafo ka coumamonamide 1, coumamonamide acid 6, kapa KAND 11 ha ea ka ea ama li-microtubules liseleng tsa HeLa (Setšoantšo sa SI S7). Kahoo, mokhoa oa ts'ebetso oa KAND 11 ho lumeloa hore o fapane le oa li-cytoskeleton disruptors tse tsejoang. Ho phaella moo, ho shebella ha rona ka microscope lisele tsa BY-2 tse phekoloang ka KAND 11 ho senotse qalo ea lefu la sele nakong ea kalafo ea KAND 11 'me ho bontšitse hore karolo ea lisele tse shoeleng tse nang le 'mala o moputsoa oa Evans ha ea ka ea eketseha haholo kamora metsotso e 30 ea kalafo ea KAND 11, athe kamora metsotso e 90 ea kalafo ka 50 μM kapa 100 μM KAND, palo ea lisele tse shoeleng e eketsehile ho fihla ho 43.7% kapa 80.1%, ka ho latellana (Setšoantšo sa 7c). Ha li kopanngoa, lintlha tsena li bontša hore KAND 11 e ncha e tsoang ho ursolic acid ke sethibela-mafu se ikhethileng sa cytoskeletal se nang le mokhoa oa ts'ebetso o neng o sa tsejoe pele.
KAND e ama di-microtubule tsa cortical, di-filament tsa actin, le ho phela ha disele tsa BY-2 tsa koae. (a) Pono ya di-microtubule tsa cortical diseleng tsa BY-2 moo ho nang le TagRFP-TUA6. Disele tsa BY-2 tse phekotsweng ka KAND 11 (50 μM kapa 100 μM) kapa DMSO di hlahlobilwe ka microscopy ya confocal. Botenya ba di-microtubule tsa cortical bo badilwe ho tswa ho di-micrograph tsa disele tse 25 tse ikemetseng. Ditlhaku di bontsha dipharologanyo tse kgolo (Teko ya Tukey HSD, p.< 0.05). Sekala sa tekanyo = 10 µm. (b) Li-filament tsa actin tsa cortical liseleng tsa BY-2 tse bonoang boteng ba GFP-ABD2. Lisele tsa BY-2 tse phekoloang ka KAND 11 (50 μM kapa 100 μM) kapa DMSO li hlahlobiloe ka microscopy ea confocal. Bongata ba li-filament tsa actin tsa cortical bo baliloe ho tsoa ho li-micrograph tsa lisele tse 25 tse ikemetseng. Litlhaku li bontša liphapang tse kholo (Teko ea Tukey HSD, p< 0.05). Sekala sa tekanyo = 10 µm. (c) Ho shejwa ha disele tsa BY-2 tse shweleng ka ho daya ka boputswa ba Evans. Disele tsa BY-2 tse phekotsweng ka KAND 11 (50 μM kapa 100 μM) kapa DMSO di hlahlobilwe ka microscopy ya lebala le kganyang. n=3. Sekala sa tekanyo = 100 µm.
Ho sibolloa le ho sebelisoa ha lihlahisoa tse ncha tsa tlhaho ho lebisitse tsoelo-peleng e kholo likarolong tse fapaneng tsa bophelo ba batho, ho kenyeletsoa meriana le temo. Lipatlisiso tsa nalane li entsoe ho fumana metsoako e thusang mehloling ea tlhaho. Haholo-holo, li-actinomycetes li tsejoa li le molemo e le lithibela-mafu tse thibelang likokoana-hloko bakeng sa li-nematode ka lebaka la bokhoni ba tsona ba ho hlahisa li-metabolite tse fapaneng tsa bobeli tse kang avermectin, motsoako o ka sehloohong oa ivermectin le bleomycin le li-derivatives tsa eona, tse sebelisoang meriana e le moemeli oa mofetše21,22. Ka mokhoa o ts'oanang, mefuta e fapaneng ea metsoako e bolaeang litlama e fumanoe ho tsoa ho actinomycetes, tseo tse ling tsa tsona li seng li ntse li sebelisoa khoebong1,23. Ka hona, tlhahlobo ea li-metabolite tsa actinomycete ho arola lihlahisoa tsa tlhaho tse nang le mesebetsi e lakatsehang ea baeloji e nkoa e le leano le sebetsang. Thutong ena, re fumane motsoako o mocha, coumamonamide, o tsoang ho S. werraensis 'me ra o kopanya ka katleho. Ursonic acid ke motsoako oa maiketsetso oa urbenamide le li-derivatives tsa eona. E ka baka ho kobeha ha metso ka mokhoa o ikhethang, ea bontša ts'ebetso e itekanetseng ho isa ho e matla ea ho bolaea litlama, 'me ea senya li-microtubules tsa limela ka kotloloho kapa ka tsela e sa tobang. Leha ho le jwalo, mokgwa wa tshebetso ya urmotonic acid o ka fapana le wa di-microtubule inhibitors tse seng di ntse di le teng, kaha KAND 11 le yona e sitisa di-filament tsa actin mme e baka lefu la sele, e leng se fanang ka maikutlo a mokgwa wa taolo oo urmotonic acid le di-derivatives tsa yona di susumetsang mefuta e mengata ya dibopeho tsa cytoskeletal.
Tlhaloso e qaqileng ea urbenonic acid e tla thusa ho utloisisa hamolemo mokhoa oa ts'ebetso ea urbenonic acid. Haholo-holo, sepheo se latelang ke ho lekola bokhoni ba ursonic acid ba ho tlama ho li-microtubules tse fokotsehileng ho fumana hore na ursonic acid le lihlahisoa tsa eona li sebetsa ka kotloloho ho li-microtubules le ho li tlosa polymerize, kapa hore na ketso ea tsona e fella ka ho senyeha ha microtubule. Ho phaella moo, tabeng eo li-microtubules e seng sepheo se tobileng, ho khetholla sebaka sa ts'ebetso le lipheo tsa limolek'hule tsa ursonic acid liseleng tsa limela ho tla thusa ho utloisisa haholoanyane thepa ea metsoako e amanang le eona le litsela tse ka khonehang tsa ho ntlafatsa ts'ebetso ea ho bolaea litlama. Teko ea rona ea bioactivity e senotse bokhoni bo ikhethang ba cytotoxic ba ursonic acid kholong ea limela tse kang Arabidopsis thaliana, koae le liverwort, ha lisele tsa E. coli kapa HeLa li sa ameha. Chefo e nyane kapa ha e eo liseleng tsa liphoofolo ke molemo oa li-derivatives tsa ursonic acid haeba li ntlafalitsoe e le li-herbicide bakeng sa ts'ebeliso masimong a bulehileng a temo. Ka 'nete, kaha li-microtubules ke meaho e tloaelehileng ho eukaryotes, thibelo ea tsona e khethiloeng limela ke tlhoko ea bohlokoa bakeng sa li-herbicide. Mohlala, propyzamide, e leng sesebelisoa sa ho tlosa li-microtubule depolymerizing se tlamang ka ho toba ho tubulin le ho thibela polymerization, se sebelisoa e le sebolaya-dikokwana-hloko ka lebaka la chefo ea sona e tlase liseleng tsa liphoofolo24. Ho fapana le disopyramide, li-benzamide tse amanang le tsona li na le litšoaneleho tse fapaneng tsa sepheo. Ntle le li-microtubules tsa limela, RH-4032 kapa benzoxamide le eona e thibela li-microtubules tsa lisele tsa liphoofolo kapa oomycetes, ka ho latellana, 'me zalilamide e sebelisoa e le sebolaya-dikokwana-hloko ka lebaka la chefo ea eona e tlase ea phyto25,26,27. Bere e sa tsoa sibolloa le lintho tse tsoang ho eona li bontša chefo e khethehileng khahlanong le limela, empa hoa bohlokoa ho hlokomela hore liphetoho tse ling li ka fetola ho totobala ha tsona, tse ka fanang ka lintho tse ling tse tsoang ho tsona bakeng sa taolo ea li-fungus tse bakang pathogenic kapa oomycetes.
Thepa e ikhethang ea urbenonic acid le metsoako ea eona e thusa nts'etsopele ea tsona e le meriana ea litlama le tšebeliso ea eona e le lisebelisoa tsa lipatlisiso. Bohlokoa ba cytoskeleton ho laoleng sebopeho sa sele ea semela bo tsejoa haholo. Lithuto tsa pejana li bontšitse hore limela li hlahisitse mekhoa e rarahaneng ea mokhatlo oa cortical microtubule ka ho laola matla a microtubule ho laola mofetoheli hantle. Palo e kholo ea limolek'hule tse ikarabellang bakeng sa taolo ea ts'ebetso ea microtubule e se e fumanoe, 'me lipatlisiso tse amanang le eona li ntse li tsoela pele3,4,28. Kutloisiso ea rona ea hona joale ea matla a microtubule liseleng tsa limela ha e hlalose ka botlalo mekhoa ea mokhatlo oa cortical microtubule. Mohlala, le hoja disopyramide le oryzalin ka bobeli li ka fokotsa li-microtubule, disopyramide e baka ho sotha ho matla ha metso ha oryzalin e na le phello e bobebe. Ho feta moo, liphetoho tse teng ho tubulin, tse tsitsitseng microtubule, le tsona li baka dextrorotation metsong, athe paclitaxel, e boetse e tsitsisa matla a microtubule, ha e etse joalo. Ka hona, ho ithuta le ho khetholla lipheo tsa limolek'hule tsa ursolic acid ho lokela ho fana ka temohisiso e ncha mabapi le taolo ea li-microtubule tsa cortical tsa limela. Ka ho tšoanang, papiso ea nakong e tlang ea lik'hemik'hale tse sebetsang hantle ho ntšetseng pele kholo e sothehileng, joalo ka disopyramide, le lik'hemik'hale tse sa sebetseng hantle, joalo ka oryzalin kapa kumamotoric acid, e tla fana ka leseli la hore na kholo e sothehileng e etsahala joang.
Ka lehlakoreng le leng, ho hlophisoa bocha ha li-cytoskeletal tse amanang le tšireletso ke monyetla o mong oa ho hlalosa chefo ea ursonic acid. Tšoaetso ea pathogen kapa ho kenngoa ha elicitor liseleng tsa limela ka linako tse ling ho baka tšenyo ea cytoskeleton le lefu le latelang la sele29. Mohlala, cryptoxanthin e tsoang ho oomycete e tlalehiloe e sitisa li-microtubules le li-filament tsa actin pele ho lefu la sele ea koae, ho tšoana le se etsahalang ka kalafo ea KAND30,31. Ho tšoana pakeng tsa likarabo tsa tšireletso le likarabo tsa sele tse bakoang ke ursonic acid ho re lebisitse ho nahana hore li baka lits'ebetso tse tloaelehileng tsa sele, leha phello e potlakileng le e matla ea ursonic acid ho feta cryptoxanthin e bonahala. Leha ho le joalo, lithuto li bontšitse hore tšitiso ea li-filament tsa actin e khothalletsa lefu la sele le sa reroang, leo e seng kamehla le tsamaeang le tšitiso ea microtubule29. Ho phaella moo, ho ntse ho tla bonoa hore na pathogen kapa elicitor e baka kholo e sothehileng ea metso, joalo ka ha li-derivatives tsa ursonic acid li etsa. Kahoo, tsebo ea limolek'hule e hokahanyang likarabo tsa tšireletso le cytoskeleton ke bothata bo khahlang bo lokelang ho rarolloa. Ka ho sebelisa boteng ba metsoako e boima bo tlase ba limolek'hule e amanang le ursonic acid, hammoho le mefuta e fapaneng ea lintho tse tsoang ho eona tse nang le matla a fapaneng, li ka fana ka menyetla ea ho shebana le mekhoa e sa tsejoeng ea sele.
Ha ho kopanngoa, ho sibolloa le ho sebelisoa ha metsoako e mecha e fetolang matla a microtubule ho tla fana ka mekhoa e matla ea ho sebetsana le mekhoa e rarahaneng ea limolek'hule e thehiloeng qetong ea sebopeho sa sele ea semela. Moelelong ona, motsoako o sa tsoa hlahisoa oa urmotonic acid, o amang li-microtubule le li-filament tsa actin le ho baka lefu la sele, o ka fana ka monyetla oa ho utloisisa kamano pakeng tsa taolo ea microtubule le mekhoa ena e meng. Kahoo, tlhahlobo ea lik'hemik'hale le ea baeloji e sebelisang urbenonic acid e tla re thusa ho utloisisa mekhoa ea taolo ea limolek'hule e laolang cytoskeleton ea semela.
Ente ea S. werraensis MK493-CF1 ka har'a flask ea Erlenmeyer ea 500 mL e nang le 110 mL ea peo e nang le 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) Essence paste, 1% (w/v) motsoako oa Bacto. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) poone e ntšoang (KOGOSTCH Co., Ltd., Japane), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 le 0.2% CaCO3 ka metsing a hloekisitsoeng. (pH 7.4 pele ho sterilization). Lijalo tsa peo li ile tsa bolokoa ka har'a rotary shaker (180 rpm) ho 27°C matsatsi a 2. Temo ea tlhahiso ka ho belisoa ha solid state. Semela sa peo (7 ml) se ile sa fetisetswa ka hara botlolo ya 500 ml ya K-1 e nang le 40 g ya setshelo sa tlhahiso se nang le 15 g ya harese e hatelletsweng (MUSO Co., Ltd., Japane) le 25 g ya metsi a qhibilihisitsweng (pH ha e a lokiswa pele ho sterilization). Ho bela ho ile ha etswa ka 30°C lefifing ka matsatsi a 14. Thepa ya ho bela e ile ya ntshuwa ka 40 ml/botlolo ya EtOH mme ya kenngwa ka sentrifuge (1500 g, 4°C, metsotso e 10). Supernatant ya semela (60 ml) e ile ya ntshuwa ka motswako wa 10% MeOH/EtOAc. Lera la tlhaho le ile la fetoha mouoane tlas'a khatello e fokotsehileng ho fumana masala (59.5 mg), a ileng a kenngoa ho HPLC ka ho hlapolla gradient (metsotso e 0-10: 90%) kholomong ea mohato o ka morao (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × bolelele 250 mm) H2O/CH3CN, metsotso e 10-35: 90% H2O/CH3CN ho isa ho 70% H2O/CH3CN (gradient), metsotso e 35-45: 90% H2O/EtOH, metsotso e 45-155: 90% H2O/EtOH ho isa ho 100% EtOH (gradient (gradient), metsotso e 155-200: 100% EtOH) ka sekhahla sa phallo sa 1.5 ml/min, coumamonamide (1, 36.0 mg) e ile ea aroloa e le phofo e tšoeu e sa fetoheng.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ boleng bo baliloeng: 141.0659, boleng bo lekantsoeng: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Peo ea Columbia (Col-0) e fumanoe ho Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) ka tumello ea ho e sebelisa lipatlisisong. Peo ea Col-0 e ile ea jaloa le ho bolokoa tlas'a maemo a laboratori ea rona 'me ea sebelisoa e le limela tsa Arabidopsis tsa mofuta oa naha. Peo ea Arabidopsis e ile ea hloekisoa holim'a metsi 'me ea lengoa ka har'a Murashige le Skoog medium tse matla tse nang le 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) le 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, ho 23 °C le khanya e sa fetoheng. Peo ea phs1-1 mutant e fanoe ke T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Peo ea mofuta oa SR-1 e fanoe ke T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) 'me ea sebelisoa e le limela tsa koae tsa mofuta oa naha. Peo ea koae e ile ea hloekisoa holim'a metsi 'me ea ineloa ka metsing a hloekileng ka masiu a mararo ho khothaletsa ho mela, ebe e kenngoa ka tharollong ea halofo ea matla e nang le 2% sucrose, 0.05% (w/v) MES, le 0.8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. le Skoog medium) e nang le pH ea 5.7 'me ea bolokoa mochesong oa 23°C tlas'a khanya e sa khaotseng.
Strain Tak-1 e fanoe ke T. Kohchi (Univesithi ea Kyoto) 'me e sebelisitsoe e le yuniti e tloaelehileng ea liteko bakeng sa thuto ea liverwort. Gemma e fumanoe ho tsoa limela tse lengoang tse hloekisitsoeng ebe e pentiloe holim'a Gamborg B5 medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) e nang le 1% ea sucrose le 0.3% ea gellan gum 'me ea beoa mochesong oa 23°C tlas'a khanya e tsoelang pele.
Lisele tsa koae tsa BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) li fanoe ke S. Hasezawa (Univesithi ea Tokyo). Lisele tsa BY-2 li ile tsa hlapolloa ka makhetlo a 95 ka har'a Linsmeier e fetotsoeng le Skoog medium 'me tsa tlatsetsoa beke le beke ka 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32. Sele e emisitsoeng e ne e kopantsoe holim'a rotary shaker ka 130 rpm ka 27°C lefifing. Hlatsoa lisele ka makhetlo a 10 a bophahamo ba medium e ncha 'me u li tsosolose hape ka har'a medium e tšoanang. Mela ea lisele tsa BY-2 tse feto-fetohang tse hlahisang letšoao la microtubule TagRFP-TUA6 kapa letšoao la actin filament GFP-ABD2 tlas'a kokoana-hloko ea cauliflower mosaic 35S e hlahisitsoe joalo ka ha ho hlalositsoe33,34,35. Mela ena ea lisele e ka bolokoa le ho hokahanngoa ho sebelisoa mekhoa e ts'oanang le e sebelisitsoeng bakeng sa mola oa pele oa sele oa BY-2.
Lisele tsa HeLa li ile tsa lengoa ka har'a Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) e tlatselitsoeng ka 10% fetal bovine serum, 1.2 U/ml penicillin, le 1.2 μg/ml streptomycin ka har'a incubator ea 37°C e nang le 5% CO2.
Liteko tsohle tse hlalositsoeng sengolweng sena li entsoe ho latela melao le litataiso tsa polokeho ea likokoana-hloko tsa Japane.
Metswako e ile ea qhibilihisoa ka har'a dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) e le litharollo tsa setoko 'me ea tsoakoa ka har'a MS medium bakeng sa Arabidopsis le koae kapa Gamborg B5 medium bakeng sa liverwort. Bakeng sa teko ea thibelo ea kholo ea metso, peo e fetang 10 ka poleiti e ile ea jaloa holim'a agar medium e nang le metsoako e bontšitsoeng kapa DMSO. Peo e ile ea beoa ka kamoreng ea kholo ka matsatsi a 7. Lipeo li ile tsa nkuoa lifoto 'me bolelele ba metso ba lekanngoa. Bakeng sa teko ea ho mela ha Arabidopsis, peo tse 48 ka poleiti li ile tsa jaloa holim'a agar medium e nang le motsoako oa 200 μM kapa DMSO. Peo ea Arabidopsis e ile ea lengoa ka kamoreng ea kholo 'me palo ea lipeo tse melang e ile ea baloa matsatsi a 7 kamora ho mela (dag). Bakeng sa teko ea ho mela ha koae, peo tse 24 ka poleiti li ile tsa jaloa holim'a agar medium e nang le 200 μM KAND kapa DMSO. Peo ea koae e ile ea lengoa ka kamoreng ea kholo 'me palo ea lipeo tse melang e ile ea baloa kamora matsatsi a 14. Bakeng sa teko ea thibelo ea kholo ea liverwort, mahe a 9 a tsoang poleiting ka 'ngoe a ile a manehoa holim'a agar medium e nang le mahloriso a bontšitsoeng a KAND kapa DMSO 'me a bolokoa ka kamoreng ea kholo matsatsi a 14.
Sebelisa lipeo tse daelitsoeng ka 5 mg/ml propidium iodide (PI) ho bona sebopeho sa metso ea meristem. Matšoao a PI a bonoe ka microscopy ea fluorescence ho sebelisoa microscope ea TCS SPE confocal laser scanning (Leica Microsystems).
Ho silafatsa metso ka histochemical ka β-glucuronidase (GUS) ho entswe ho ya ka protocol e hlalositsweng ke Malami le Benfey36. Dipeo di ile tsa kenngwa ka hara 90% acetone bosiu bohle, tsa tshwaetswa ka 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid ka hara GUS buffer ka hora e le nngwe mme tsa bewa ka hara tharollo ya chloraldehyde e nang le metsi. (8 g ya chloral hydrate, 2 ml ya metsi le 1 ml ya glycerol) mme tsa shejwa ka microscopy ya phapang e fapaneng ho sebediswa microscope ya Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Likhutlo tsa metso li lekantsoe ho lipeo tse nang le matsatsi a 7 tse holisitsoeng lipoleiting tse behiloeng ka ho otloloha. Lekanya sekhutlo sa motso ho tloha lehlakoreng la vector ea matla a khoheli joalokaha ho hlalositsoe mohatong oa 6.
Tlhophiso ea li-microtubules tsa cortical e bonoe joalo ka ha e hlalositsoe, ka liphetoho tse nyane ho protocol ea 37. Anti-β-tubulin antibody (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) le Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) li sebelisitsoe e le li-antibodies tsa mantlha le tsa bobeli ho 1:1000 le 1:100 dilutions, ka ho latellana. Litšoantšo tsa Fluorescence li fumanoe ho sebelisoa microscope ea TCS SPE confocal laser scanning (Leica Microsystems). Fumana litšoantšo tsa Z-stack 'me u thehe likhakanyo tsa matla a maholo ho latela litaelo tsa moetsi.
Teko ea ho ata ha lisele tsa HeLa e entsoe ho sebelisoa Sete ea ho Bala Lisele ea 8 (Dojindo) ho latela litaelo tsa moetsi.
Kgolo ya E. coli DH5α e ile ya sekasekwa ka ho lekanya bongata ba disele ka hara setso ho sebediswa spectrophotometer ho 600 nm (OD600).
Ho hlophisoa ha cytoskeletal liseleng tsa BY-2 tse fetotsoeng liphatsa tsa lefutso ho ile ha bonoa ho sebelisoa microscope ea fluorescence e nang le sesebelisoa sa ho hlahloba sa confocal sa CSU-X1 (Yokogawa) le khamera ea sCMOS (Zyla, Andor Technology). Bongata ba cytoskeletal bo ile ba hlahlojoa ka tlhahlobo ea setšoantšo, e ileng ea lekanya peresente ea li-pixel tsa cytoskeletal har'a li-pixel tsa cytoplasmic litšoantšong tsa confocal ho sebelisoa software ea ImageJ joalo ka ha ho hlalositsoe38,39.
Ho lemoha lefu la sele liseleng tsa BY-2, karolo e le 'ngoe ea sele e emisitsoeng e ile ea kenngoa ka 0.05% Evans blue metsotso e 10 mochesong oa kamore. Ho daea lisele tse shoeleng ka boputsoa ba Evans ho itšetlehile ka ho ntšoa ha dae liseleng tse phelang ke lera la plasma le sa senyehang40. Lisele tse nang le matheba li ile tsa bonoa ho sebelisoa microscope ea lebala le khanyang (BX53, Olympus).
Lisele tsa HeLa li holisitsoe ho DMEM tse tlatselitsoeng ka 10% FBS ka har'a incubator e mongobo ho 37°C le 5% CO2. Lisele li ile tsa phekoloa ka 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), kapa 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) ka lihora tse 6 ho 37°C. Lisele li ile tsa lokisoa ka MetOH ka metsotso e 10 ebe li fuoa acetate ka metsotso e 5 mochesong oa kamore. Lisele tse tsitsitseng li ile tsa lokisoa ka antibody ea mantlha ea β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) e hlapolotsoeng ka 0.5% BSA/PBS ka lihora tse 2, tsa hlatsuoa ka makhetlo a 3 ka TBST, ebe li fuoa antibody ea Alexa Fluor goat. 488 Hora e le 'ngoe. – Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) le 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e hlapolotsoeng ka 0.5% BSA/PBS. Kamora ho hlatsuoa ka TBST ka makhetlo a mararo, lisele tse nang le matheba li ile tsa bonoa ho microscope e fetoletsoeng ea Nikon Eclipse Ti-E. Litšoantšo li ile tsa nkuoa ka khamera e pholileng ea Hamamatsu ORCA-R2 CCD ho sebelisoa software ea MetaMorph (Lisebelisoa tsa Molecular).
Nako ea poso: Phuptjane-17-2024