Ho hola hoa apical meristem (SAM) ho bohlokoa bakeng sa meralo ea kutu. Li-hormone tsa limelali-gibberellins(GAs) e bapala karolo ea bohlokoa ho hokahanya kholo ea limela, empa karolo ea bona ho SAM e ntse e sa utloisisoe hantle. Mona, re thehile biosensor ea ratiometric ea pontšo ea GA ka boenjiniere ba protheine ea DELLA ho hatella ts'ebetso ea eona ea bohlokoa ea taolo karabong ea GA transcriptional ha e ntse e boloka tšenyeho ea eona holim'a kananelo ea GA. Re bontša hore biosensor ena e thehiloeng ho senyeha e tlaleha ka nepo liphetoho tsa maemo a GA le kutlo ea lisele nakong ea nts'etsopele. Re sebelisitse biosensor ena ho etsa 'mapa oa tšebetso ea lipontšo tsa GA ho SAM. Re bonts'a hore mats'oao a phahameng a GA a teng haholo liseleng tse lipakeng tsa organ primordia, e leng selelekela sa lisele tsa internode. Re sebelisa mekhoa ea ho rua le ho lahleheloa ke ts'ebetso, re bonts'a hape hore GA e laola mokhoa oa sefofane sa karohano ea lisele, ho theha mokhatlo o hlophisitsoeng oa cellular oa li-internodes, ka hona o khothaletsa litlhaloso tsa internode ho SAM.
The shoot apical meristem (SAM), e sebakeng sa letlobo, e na le sehlopha sa lisele tsa stem tseo tšebetso ea tsona e hlahisang litho tse ka morao le li-stem nodes ka mokhoa o tloaelehileng le o pheta-phetoang bophelo bohle ba semela. E 'ngoe le e 'ngoe ea lihlopha tsena tse iphetang, kapa li-node tsa limela, li kenyelletsa li-internode le litho tse ka thōko ho nodes, le li-axillary meristems li-axils tsa lekhasi1. Khōlo le ho hlophisoa ha limela tsa limela li fetoha nakong ea tsoelo-pele. Ho Arabidopsis, khōlo ea internodal e hatelloa nakong ea limela, 'me li-axillary meristems li lula li robetse li-axils tsa makhasi a rosette. Nakong ea phetoho ho ea karolong ea lipalesa, SAM e fetoha inflorescence meristem, e hlahisang li-internode tse telele le li-axillary buds, makala a li-axils tsa makhasi a cauline, 'me hamorao, lipalesa tse se nang makhasi2. Le hoja re entse tsoelo-pele e khōlō tabeng ea ho utloisisa mekhoa e laolang ho qala ha makhasi, lipalesa le makala, ha ho tsejoe hakaalo ka hore na li-internode li hlaha joang.
Ho utloisisa kabo ea sebaka sa li-GAs ho tla thusa ho utloisisa hamolemo mesebetsi ea lihormone tsena ka har'a lisele tse fapaneng le ka mekhahlelo e fapaneng ea nts'etsopele. Ponahalo ea ho senyeha ha RGA-GFP fusion e hlalositsoeng tlas'a ketso ea motšehetsi oa eona e fana ka tlhahisoleseding ea bohlokoa mabapi le taolo ea kakaretso ea GA ka metso15,16. Leha ho le joalo, polelo ea RGA e fapana ho ea ka lithane17 mme e laoloa ke GA18. Ka hona, polelo e fapaneng ea mothetsi oa RGA e ka fella ka mokhoa oa fluorescence o hlokometsoeng le RGA-GFP 'me kahoo mokhoa ona ha o na palo. Haufinyane tjena, bioactive fluorescein (Fl) -e ngotsoeng GA19,20 e senotse ho bokellana ha GA motsong oa endocortex le taolo ea maemo a eona a cellular ka lipalangoang tsa GA. Haufinyane tjena, sensor ea GA FRET nlsGPS1 e bonts'itse hore maemo a GA a amana le bolelele ba sele metsong, likhoele, le hypocotyls e lefifi21. Leha ho le joalo, joalo ka ha re bone, mahloriso a GA ha se eona feela paramente e laolang ts'ebetso ea lipontšo tsa GA, kaha e itšetlehile ka mekhoa e rarahaneng ea ho utloa. Mona, re aha kutloisisong ea rona ea litsela tsa lipontšo tsa DELLA le GA, re tlaleha nts'etsopele le sebopeho sa biosensor ea ratiometric e thehiloeng ho senyeha bakeng sa pontšo ea GA. Ho nts'etsapele biosensor ena ea bongata, re sebelisitse RGA e sa utloahaleng ea GA e fetotsoeng e neng e kopantsoe le protheine ea fluorescent mme e hlahisoa hohle ka har'a lisele, hammoho le protheine ea GA-insensitive fluorescent. Re bonts'a hore li-protein tse fetotsoeng tsa RGA ha li kena-kenane le pontšo ea GA e sa feleng ha e hlahisoa hohle, le hore biosensor ena e ka lekanya ts'ebetso ea lipontšo e hlahisoang ke ho kenya letsoho ha GA le ts'ebetso ea lets'oao la GA ka lisebelisoa tsa kutlo tse nang le qeto e phahameng ea spatiotemporal. Re sebelisitse biosensor ena ho etsa 'mapa oa kabo ea sebaka sa ts'ebetso ea GA le ho lekanya hore na GA e laola boitšoaro ba cellular joang ho SAM epidermis. Re bonts'a hore GA e laola mokhoa oa sefofane sa karohano ea lisele tsa SAM tse pakeng tsa organ primordia, ka hona e hlalosa mokhatlo oa cellular oa karohano oa internode.
Qetellong, re ile ra botsa hore na qmRGA e ka tlaleha liphetoho tsa maemo a tlhaho a GA a sebelisa li-hypocotyl tse ntseng li hola. Re kile ra bonts'a hore nitrate e susumetsa kholo ka ho eketsa motsoako oa GA, hape, ho senyeha ha DELLA34. Ka lebaka leo, re hlokometse hore bolelele ba hypocotyl ka pUBQ10 :: lipeo tsa qmRGA tse hōlileng tlas'a phepelo e ngata ea nitrate (10 mM NO3-) e ne e le nako e telele ho feta ea lipeo tse hōlileng tlas'a maemo a haelloang ke nitrate (Supplementary Fig. 6a). Tumellanong le karabelo ea kholo, matšoao a GA a ne a phahame ho li-hypocotyl tsa lipeo tse hōlileng tlas'a maemo a 10 mM NO3- ho feta lipeo tse hōlileng ka ho ba sieo ha nitrate (Supplementary Fig. 6b, c). Ka hona, qmRGA e boetse e thusa ho lekola liphetoho ho lets'oao la GA le bakoang ke liphetoho tse sa feleng tsa khatello ea GA.
Ho utloisisa hore na ts'ebetso ea GA e bonts'itsoeng ke qmRGA e ipapisitse le khatello ea maikutlo ea GA le pono ea GA, joalo ka ha ho lebelletsoe ho ipapisitse le moralo oa sensor, re hlahlobile polelo ea li-receptor tse tharo tsa GID1 liphatseng tsa limela le tsa ho ikatisa. Ka lipeo, mohala oa moqolotsi oa litaba oa GID1-GUS o bontšitse hore GID1a le c li ne li hlahisoa haholo ka li-cotyledons (setšoantšo sa 3a-c). Ho phaella moo, li-receptors tse tharo kaofela li ne li hlahisoa ka makhasi, lateral root primordia, malebela a metso (ntle le motso oa GID1b), le tsamaiso ea methapo (setšoantšo sa 3a-c). Ka inflorescence SAM, re ile ra lemoha matšoao a GUS feela bakeng sa GID1b le 1c (Supplementary Fig. 7a–c). In situ hybridization e netefalitse mekhoa ena ea polelo mme e bonts'a hape hore GID1c e ne e hlahisoa ka mokhoa o ts'oanang maemong a tlase ho SAM, athe GID1b e bonts'itse polelo e phahameng ho periphery ea SAM (Supplementary Fig. 7d-l). Phetolelo ea pGID1b:: 2xmTQ2-GID1b e boetse e senotse mefuta e fapaneng ea polelo ea GID1b, ho tloha ho tlase kapa ho se na polelo e bohareng ba SAM ho ea ho polelo e phahameng meeling ea litho (Supplementary Fig. 7m). Kahoo, li-receptor tsa GID1 ha li aroloe ka mokhoa o ts'oanang ho pholletsa le ka har'a lisele. Litekong tse latelang, re ile ra boela ra hlokomela hore overexpression ea GID1 (pUBQ10:: GID1a-mCherry) e ile ea eketsa kutloisiso ea qmRGA ho hypocotyls ho ea ka ntle ho GA kopo (Fig. 3d, e). Ka lehlakoreng le leng, fluorescence e lekantsoeng ke qd17mRGA ho hypocotyl e ne e sa tsotelle phekolo ea GA3 (setšoantšo sa 3f, g). Bakeng sa litlhahlobo ka bobeli, lipeo li ile tsa phekoloa ka likhahla tse phahameng tsa GA (100 μM GA3) ho hlahloba boitšoaro bo potlakileng ba sensor, moo bokhoni ba ho tlama ho GID1 receptor bo ileng ba ntlafatsoa kapa ba lahleheloa. Ka kopanelo, liphetho tsena li tiisa hore biosensor ea qmRGA e sebetsa ka mokhoa o kopaneng e le sensor ea GA le GA, mme e fana ka maikutlo a hore polelo e fapaneng ea moamoheli oa GID1 e ka fetola haholo ho emissivity ea sensor.
Ho fihlela joale, kabo ea matšoao a GA ho SAM e ntse e sa hlaka. Ka hona, re sebelisitse limela tsa qmRGA-expressing le pCLV3 :: mCherry-NLS stem cell reporter35 ho bala limmapa tse nang le liqeto tse phahameng tsa mosebetsi oa pontšo ea GA, tse lebisang tlhokomelo ho L1 layer (epidermis; Fig. 4a, b, bona Mekhoa le Mekhoa ea Tlatsetso), kaha L1 e laola karolo ea bohlokoa ea SAM. Mona, pCLV3 ::polelo ea mCherry-NLS e fane ka sebaka se tsitsitseng sa litšupiso tsa geometri bakeng sa ho hlahloba kabo ea sebaka sa ts'ebetso ea GA37. Le hoja GA e nkoa e le ea bohlokoa bakeng sa nts'etsopele ea litho tsa lateral4, re hlokometse hore matšoao a GA a ne a le tlaase ho lipalesa tsa lipalesa (P) ho tloha sethaleng sa P3 (setšoantšo sa 4a, b), athe bacha ba P1 le ba P2 ba ne ba e-na le mosebetsi o itekanetseng o tšoanang le oa sebakeng se bohareng (setšoantšo sa 4a, b). Mosebetsi o phahameng oa pontšo ea GA o ile oa fumanoa meeling ea pele ea litho, ho qala ka P1 / P2 (mahlakoreng a moeli) le ho phahama ho P4, hammoho le liseleng tsohle tsa sebaka sa peripheral se pakeng tsa primordia (Fig. 4a, b le Supplementary Fig. 8a, b). Ts'ebetso ena e phahameng ea pontšo ea GA ha ea ka ea hlokomeloa feela ka har'a epidermis empa hape le L2 le likarolo tse ka holimo tsa L3 (Supplementary Fig. 8b). Mohlala oa matšoao a GA a fumanoeng ho SAM a sebelisa qmRGA le ona a lula a sa fetohe ka mor'a nako (Supplementary Fig. 8c-f, k). Le hoja mohaho oa qd17mRGA o ne o fokotsehile ka mokhoa o hlophisitsoeng ho SAM ea limela tsa T3 ho tloha meleng e mehlano e ikemetseng eo re e hlalositseng ka ho qaqileng, re khonne ho hlahloba mekhoa ea fluorescence e fumanoang ka pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP construct (Supplementary Fig. 8g-j, l). Moleng ona oa taolo, ho ile ha fumanoa liphetoho tse nyenyane feela ka tekanyo ea fluorescence ho SAM, empa setsing sa SAM re bone ho fokotseha ho hlakileng le ho sa lebelloang ho VENUS e amanang le TagBFP. Sena se tiisa hore mokhoa oa lipontšo o hlokometsoeng ke qmRGA o bonahatsa ho senyeha ho itšetlehileng ka GA ea mRGA-VENUS, empa hape e bontša hore qmRGA e ka 'na ea fetelletsa mosebetsi oa ho bontša GA setsing sa meristem. Ka bokhutšoanyane, liphetho tsa rona li senola mokhoa oa ho bonts'a GA o bonts'ang kabo ea primordia. Kabo ena ea sebaka sa li-inter-primordial (IPR) e bakoa ke ho thehoa butle-butle ha ts'ebetso e phahameng ea GA pakeng tsa primordium e ntseng e tsoela pele le sebaka se bohareng, ha ka nako e ts'oanang ts'ebetso ea GA ea pontšo ho primordium e fokotseha (Fig. 4c, d).
Kabo ea li-receptor tsa GID1b le GID1c (bona ka holimo) e fana ka maikutlo a hore polelo e fapaneng ea li-receptor tsa GA e thusa ho theha mokhoa oa ts'ebetso ea GA ho SAM. Re ile ra ipotsa hore na ho ka 'na ha ameha pokello e fapaneng ea GA. Ho etsa lipatlisiso ka monyetla ona, re sebelisitse nlsGPS1 GA FRET sensor21. Keketseho ea ts'ebetso ea ts'ebetso e ile ea fumanoa ho SAM ea nlsGPS1 e tšoaroang ka 10 μM GA4 + 7 bakeng sa 100 min (Supplementary Fig. 9a-e), e bontšang hore nlsGPS1 e arabela liphetohong tsa GA concentration ho SAM, joalokaha e etsa ka metso21. Kabo ea sebaka sa nako ea ts'ebetso ea nlsGPS1 e ile ea senola maemo a tlaase a GA likarolong tse ka ntle tsa SAM, empa a bontša hore a phahamisitsoe bohareng le meeling ea SAM (Fig. 4e le Supplementary Fig. 9a, c). Sena se fana ka maikutlo a hore GA e boetse e ajoa ho SAM ka mokhoa oa sebaka o bapisoang le o senotsoeng ke qmRGA. E le mokhoa o tlatsetsang, re boetse re tšoara SAM ka fluorescent GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) kapa Fl feela e le taolo e mpe. Letšoao la Fl le ile la ajoa ho pholletsa le SAM, ho kenyelletsa le sebaka se bohareng le primordium, le hoja e le ka matla a tlaase (Fig. 4j le Supplementary Fig. 10d). Ka lehlakoreng le leng, GA-Fl e meraro e ile ea bokelloa ka ho khetheha ka har'a meeli ea pele le ho ea ka likhato tse fapaneng karolong e 'ngoe ea IPR, le GA7-Fl e bokellana sebakeng se seholohali ho IPR (Fig. 4k le Supplementary Fig. 10a,b). Quantification of fluorescence intensity e senoletse hore IPR ho non-IPR intensity ratio e ne e phahame ho SAM e tšoaroang ke GA-Fl ha e bapisoa le Fl-treated SAM (Fig. 4l le Supplementary Fig. 10c). Ka kopanelo, liphetho tsena li fana ka maikutlo a hore GA e teng maemong a holimo ho lisele tsa IPR tse haufi le moeli oa setho. Sena se fana ka maikutlo a hore mohlala oa ts'ebetso ea SAM GA e bonts'a ts'ebetso ea ho bonts'a matšoao ho tsoa ho polelo e fapaneng ea li-receptor tsa GA le pokello e fapaneng ea GA liseleng tsa IPR haufi le meeli ea litho. Ka hona, tlhahlobo ea rona e senotse mokhoa o sa lebelloang oa sebaka sa GA sa pontšo, se nang le ts'ebetso e tlaase bohareng le primordium ea SAM le mosebetsi o phahameng ho IPR sebakeng sa peripheral.
Ho utloisisa karolo ea ts'ebetso e fapaneng ea lipontšo tsa GA ho SAM, re hlahlobile kamano lipakeng tsa ts'ebetso ea ho bonts'a GA, katoloso ea lisele, le karohano ea lisele re sebelisa litšoantšo tsa nako ea nako ea nnete ea SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Ho latela karolo ea GA taolong ea kholo, ho ne ho lebelletsoe khokahano e ntle le liparamente tsa katoloso ea lisele. Ka hona, re ile ra qala ka ho bapisa limmapa tsa ts'ebetso ea pontšo ea GA le limmapa tsa sekhahla sa kholo ea lisele (e le moemeli oa matla a ho atolosoa ha sele bakeng sa sele e fanoeng le bakeng sa lisele tsa morali ka karohano) le ka limmapa tsa kholo ea anisotropy, e lekanyang tataiso ea ho atolosoa ha sele (e sebelisoang mona bakeng sa sele e fanoeng le bakeng sa lisele tsa morali karohano; Fig. 5a,b, bona Mekhoa ea Tlatsetso le Mekhoa ea Tlatsetso). Limmapa tsa rona tsa sekhahla sa kholo ea lisele tsa SAM li lumellana le litebello tse fetileng38,39, tse nang le litekanyetso tse fokolang tsa ho hōla moeling le litekanyetso tse kholo tsa ho hōla ha lipalesa tse ntseng li hōla (Setšoantšo sa 5a). Tlhahlobo ea karolo e ka sehloohong (PCA) e bonts'itse hore ts'ebetso ea ho bonts'a GA e ne e amana hampe le matla a kholo ea selefouno (Setšoantšo sa 5c). Re ile ra boela ra bontša hore li-axes tse ka sehloohong tsa ho fapana, ho kenyelletsa le ho kenya letšoao la GA le matla a ho hōla, li ne li le orthogonal ho tataiso e khethiloeng ke polelo e phahameng ea CLV3, e tiisang ho tlosoa ha lisele tse tsoang setsing sa SAM litlhahlobong tse setseng. Tlhahlobo ea ho hokahanya ha Spearman e tiisitse liphello tsa PCA (Setšoantšo sa 5d), e bontšang hore lipontšo tse phahameng tsa GA ho IPR ha lia ka tsa fella ka ho atolosoa ha lisele tse phahameng. Leha ho le joalo, tlhahlobo ea khokahano e senotse khokahano e nyane e ntle lipakeng tsa ts'ebetso ea GA le kholo ea anisotropy (Setšoantšo sa 5c, d), se fana ka maikutlo a hore pontšo e phahameng ea GA ho IPR e susumetsa tataiso ea kholo ea lisele mme mohlomong le boemo ba sefofane sa karohano ea lisele.
a, b Limmapa tse futhumatsang tsa kholo ea bokaholimo (a) le kholo ea anisotropy (b) ho SAM e fetelletseng limela tse ikemetseng tse supileng (tse sebelisoang e le li-proxies bakeng sa matla le tataiso ea katoloso ea lisele, ka ho latellana). c Tlhahlobo ea PCA e kenyelelitse mefuta e latelang: Letšoao la GA, matla a ho hōla holim'a metsi, anisotropy ea ho hōla ha holim'a metsi, le polelo ea CLV3. Karolo ea 1 ea PCA e ne e amana haholo le matla a kholo ea bokaholimo mme e ne e amana hantle le lets'oao la GA. Karolo ea 2 ea PCA e ne e amana haholo le anisotropy ea kholo ea bokaholimo mme e ne e amana hampe le polelo ea CLV3. Liphesente li emela phapang e hlalosoang ke karolo ka 'ngoe. d Tlhahlobo ea khokahano ea Spearman lipakeng tsa lets'oao la GA, matla a kholo ea bokaholimo, le anisotropy ea kholo ea bokaholimo boemong ba lisele ntle le CZ. Nomoro e ka ho le letona ke boleng ba Spearman rho pakeng tsa mefuta e 'meli. Linaleli li bonts'a maemo ao khokahano e mpe /negative e leng bohlokoa haholo. Setšoantšo sa 3D sa lisele tsa Col-0 SAM L1 ka confocal microscopy. Mabota a macha a lisele tse entsoeng ho SAM (empa eseng primordium) ka 10 h a na le mebala ho latela litekanyetso tsa bona tsa mahlakore. Lebala la mebala le bonts'oa hukung e ka tlase ho le letona. Inset e bonts'a setšoantšo se ts'oanang sa 3D ka 0 h. Teko e phetoa habeli ka liphetho tse tšoanang. f Merero ea mabokose e bonts'a litefiso tsa karohano ea lisele ho IPR le non-IPR Col-0 SAM (n = 10 limela tse ikemetseng). Mohala o bohareng o bontša bohareng, 'me meeli ea lebokose e bontša karolo ea 25 le ea 75. Li-Whiskers li bonts'a boleng bo tlase le bo phahameng bo behiloeng ka software ea R. Litekanyetso tsa P li fumanoe ka tlhahlobo ea t-tailed ea Welch. g, h Setšoantšo sa Schematic se bontšang (g) mokhoa oa ho lekanya angle ea lerako le lecha la sele (magenta) mabapi le tataiso ea radial ho tloha bohareng ba SAM (mola o matheba o mosoeu) (ho nahanoa feela litekanyetso tse matla tsa angle, ke hore, 0–90 °), le (h) litsela tse pota-potileng / lateral le radial ka har'a meristem. i Frequency histograms ea sebopeho sa sefofane sa karohano ea lisele ho pholletsa le SAM (boputsoa bo lefifi), IPR (boputsoa bo mahareng), le non-IPR (boputsoa bo bobebe), ka ho latellana. Litekanyetso tsa P li fumanoe ka tlhahlobo ea mehatla e 'meli ea Kolmogorov-Smirnov. Teko e phetoa habeli ka liphetho tse tšoanang. j Frequency histograms of cell division plane orientation of the IPR around P3 (light light), P4 (botala bo mahareng), le P5 (botala bo lefifi), ka ho latellana. Litekanyetso tsa P li fumanoe ka tlhahlobo ea mehatla e 'meli ea Kolmogorov-Smirnov. Teko e phetoa habeli ka liphetho tse tšoanang.
Ka hona, ka mor'a moo re ile ra batlisisa kamano pakeng tsa pontšo ea GA le mosebetsi oa karohano ea lisele ka ho khetholla marako a sele a sa tsoa thehoa nakong ea tlhahlobo (setšoantšo sa 5e). Mokhoa ona o ile oa re lumella ho lekanya maqhubu le tataiso ea karohano ea lisele. Hoa makatsa hore ebe re fumane hore makhetlo a mangata a likarohano tsa lisele ho IPR le tse ling kaofela tsa SAM (e seng IPR, Fig. 5f) li ne li tšoana, tse bontšang hore phapang pakeng tsa GA pakeng tsa IPR le lisele tse seng tsa IPR ha e ame haholo karohano ea lisele. Sena, le kamano e ntle pakeng tsa pontšo ea GA le kholo ea anisotropy, e ile ea re susumelletsa ho nahana hore na mosebetsi oa pontšo ea GA o ka susumetsa tsela eo sefofane sa karohano ea lisele se leng teng. Re ile ra lekanya sebopeho sa lerako le lecha la sele e le angle e bohale e amanang le radial axis e kopanyang setsi sa meristem le setsi sa lerako le lecha la sele (Fig. 5e-i) 'me ra hlokomela tšekamelo e hlakileng ea hore lisele li arohane ka li-angles tse haufi le 90 ° mabapi le axis ea radial, e nang le maqhubu a phahameng ka ho fetisisa a hlokometsoeng ho 70-80 ° 6202% le 70-80 ° 62% (2%) (Setšoantšo sa 5e, i), se lumellanang le likarohano tsa lisele ka tsela e pota-potileng / e fapaneng (setšoantšo sa 5h). Ho hlahloba tlatsetso ea pontšo ea GA ho boitšoaro bona ba karohano ea lisele, re hlahlobile likarolo tsa karohano ea lisele ho IPR le bao e seng IPR ka thoko (setšoantšo sa 5i). Re hlokometse hore karohano ea mahlakore a karohano ka lisele tsa IPR e fapane le lisele tse seng tsa IPR kapa lisele tsa SAM kaofela, tse nang le lisele tsa IPR tse bontšang karolo e phahameng ea likarohano tsa lisele tsa lateral / selikalikoe, ke hore, 70-80 ° le 80-90 ° (33.86% le 30.71%, ka ho latellana, likarolo tse lekanang). Ka hona, maikutlo a rona a ile a senola kamano pakeng tsa pontšo e phahameng ea GA le mokhoa oa sefofane sa karohano ea sele haufi le tataiso e potolohileng, e tšoanang le kamano pakeng tsa ts'ebetso ea pontšo ea GA le kholo ea anisotropy (Fig. 5c, d). Ho tsoela pele ho theha paballo ea sebaka sa mokhatlo ona, re ile ra lekanya tataiso ea sefofane sa karohano liseleng tsa IPR tse potolohileng primordium ho tloha ho P3, kaha mosebetsi o phahameng ka ho fetisisa oa GA o ile oa fumanoa sebakeng sena ho tloha P4 (Fig. 4). Li-angles tsa karohano tsa IPR tse pota-potileng P3 le P4 ha lia ka tsa bontša phapang e kholo ea lipalo-palo, le hoja ho eketseha ha maqhubu a likarohano tsa lisele tsa lateral ho ile ha hlokomeloa ho IPR ho pota P4 (Fig. 5j). Leha ho le joalo, liseleng tsa IPR tse pota-potileng P5, phapang pakeng tsa tataiso ea sefofane sa karohano ea lisele e ile ea e-ba ea bohlokoa ka lipalo-palo, ka keketseho e matla ea makhetlo a mangata a likarohano tsa lisele tse fapaneng (setšoantšo sa 5j). Ka kopanelo, liphetho tsena li fana ka maikutlo a hore pontšo ea GA e ka laola mokhoa oa ho arohana ha lisele ho SAM, e lumellanang le litlaleho tse fetileng40,41 hore pontšo e phahameng ea GA e ka etsa hore ho be le lateral ea likarohano tsa lisele ho IPR.
Ho boleloa esale pele hore lisele tsa IPR li ke ke tsa kenyelletsoa ho li-primordia empa ho e-na le li-internodes2,42,43. Likarolo tse tšekaletseng tsa likarohano tsa lisele ho IPR li ka fella ka tlhophiso e tloaelehileng ea mela e bapileng ea bolelele ba lisele tsa epidermal ka har'a li-internode. Maikutlo a rona a hlalositsoeng ka holimo a fana ka maikutlo a hore pontšo ea GA e ka 'na ea e-ba le karolo ts'ebetsong ena ka ho laola tataiso ea karohano ea lisele.
Ho lahleheloa ke ts'ebetso ea mefuta e mengata ea liphatsa tsa lefutso tsa DELLA ho fella ka karabelo e tiileng ea GA, 'me della mutants e ka sebelisoa ho hlahloba khopolo-taba ena44. Re ile ra qala ka ho hlahlobisisa mekhoa ea polelo ea liphatsa tsa lefutso tse hlano tsa DELLA ho SAM. Phetolelo ea transcriptional ea GUS line45 e senotse hore GAI, RGA, RGL1, le RGL2 (ho isa tekanyong e nyenyane haholo) li hlalositsoe ho SAM (Supplementary Fig. 11a-d). In situ hybridization e ile ea boela ea bontša hore GAI mRNA e bokella ka ho khetheha ka primordia le lipalesa tse ntseng li hōla (Supplementary Fig. 11e). RGL1 le RGL3 mRNA li ile tsa fumanoa ho pholletsa le SAM canopy le lipalesa tsa khale, athe RGL2 mRNA e ne e le ngata haholo sebakeng sa moeli (Supplementary Fig. 11f–h). Litšoantšo tsa confocal tsa pRGL3 :: RGL3-GFP SAM e netefalitse polelo e hlokometsoeng ke in situ hybridization 'me e bontšitse hore protheine ea RGL3 e bokella karolong e bohareng ea SAM (Supplementary Fig. 11i). Re sebelisa pRGA :: GFP-RGA line, re boetse re fumane hore protheine ea RGA e bokella SAM, empa bongata ba eona bo fokotseha moeling ho tloha ho P4 (Supplementary Fig. 11j). Ka ho hlakileng, mekhoa ea polelo ea RGL3 le RGA e lumellana le ts'ebetso e phahameng ea GA ho IPR, joalokaha e fumanoa ke qmRGA (Fig. 4). Ho feta moo, lintlha tsena li bonts'a hore li-DELLA kaofela li hlahisoa ho SAM le hore polelo ea bona e kopane e akaretsa SAM kaofela.
Ka mor'a moo re ile ra hlahloba li-parameter tsa karohano ea lisele ka har'a mefuta ea SAM e hlaha (Ler, control) le gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutants (Setšoantšo sa 6a, b). Hoa thahasellisa hore ebe re ile ra bona phetoho e kholo ea lipalo-palo ea ho ajoa ha maqhubu a li-angle tsa karohano ho della global mutant SAM bapisoa le mofuta o hlaha (setšoantšo sa 6c). Phetoho ena ea della global mutant e ne e bakoa ke ho eketseha ha maqhubu a 80-90 ° (34.71% vs. 24.55%) le, ho isa tekanyong e fokolang, 70-80 ° angles (23.78% vs. 20.18%), ke hore, e tsamaellanang le likarohano tsa lisele tse fapaneng (Setšoantšo sa 6c). Khafetsa ea likarohano tse sa fetoheng (0-60 °) e ne e boetse e le tlaase ho della global mutant (Setšoantšo sa 6c). Khafetsa ea likarohano tsa lisele tse fapaneng li ile tsa eketseha haholo ho SAM ea della global mutant (setšoantšo sa 6b). Khafetsa ea likarohano tsa lisele tse transverse ho IPR e ne e boetse e phahame ho della global mutant ha e bapisoa le mofuta o hlaha (setšoantšo sa 6d). Ka ntle ho sebaka sa IPR, mofuta o hlaha o ne o e-na le kabo e tšoanang ea li-angles tsa karohano ea lisele, athe della global mutant e ne e rata likarohano tsa tangential joalo ka IPR (Fig. 6e). Re boetse re lekanya maemo a karohano ea lisele ho SAM ea ga2 oxidase (ga2ox) quintuple mutants (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, le ga2ox6-2), GA-inactive mutant background eo GA e bokellang teng. Tumellanong le ho eketseha ha maemo a GA, SAM ea quintuple ga2ox mutant inflorescence e ne e le kholo ho feta ea Col-0 (Supplementary Fig. 12a, b), 'me ha e bapisoa le Col-0, quintuple ga2ox SAM e bontšitse kabo e fapaneng ka ho hlaka ea li-angles tsa karohano ea lisele,' me maqhubu a angle a eketseha ho tloha ho 050, "Supplementary divisions" ho tloha ho 050 °, ho ea ho 9 Setšoantšo sa 12a–c). Kahoo, re bonts'a hore ts'ebetso ea ts'ebetso ea lipontšo tsa GA le ho bokellana ha GA ho baka likarohano tsa lisele tsa lateral ho IPR le SAM kaofela.
a, b 3D ponahatso ea L1 layer ea PI-stained Ler (a) le global della mutant (b) SAM e sebelisa confocal microscopy. Mabota a macha a lisele tse entsoeng ho SAM (empa eseng primordium) ka nako ea 10-h a bontšoa 'me a mebala ho ea ka litekanyetso tsa bona. Khatiso e bonts'a SAM ka 0 h. Lebala la mebala le bonts'oa hukung e ka tlase ho le letona. Motsu ho (b) o supa mohlala oa lifaele tsa selefouno tse hokahantsoeng ho global della mutant. Teko e phetoa habeli ka liphetho tse tšoanang. ce papiso ea khafetsa kabo ea litsamaiso tsa lifofane tsa karohano ea lisele ho SAM (d), IPR (e), le non-IPR (f) lipakeng tsa Ler le global della. Litekanyetso tsa P li ile tsa fumanoa ho sebelisoa tlhahlobo e nang le mehatla e 'meli ea Kolmogorov-Smirnov. f, g Ponahalo ea 3D ea litšoantšo tsa confocal tsa PI-stained SAM ea Col-0 (i) le pCUC2:: gai-1-VENUS (j) limela tsa transgenic. Liphanele (a, b) li bonts'a mabota a macha a lisele (empa eseng primordia) a thehiloeng ho SAM nakong ea 10 h. Teko e phetoa habeli ka liphetho tse tšoanang. h–j Ho bapisa kabo ea makhetlo a mangata a litsamaiso tsa lifofane tsa karohano ea lisele tse fumanehang ho SAM (h), IPR (i) le non-IPR (j) pakeng tsa Col-0 le pCUC2:: gai-1-VENUS limela. Litekanyetso tsa P li fumanoe ho sebelisoa tlhahlobo ea mehatla e 'meli ea Kolmogorov-Smirnov.
Ka mor'a moo re ile ra leka phello ea ho thibela pontšo ea GA ka ho khetheha ho IPR. Ho fihlela sena, re sebelisitse motlatsi oa cotyledon cup 2 (CUC2) ho khanna polelo ea protheine e mpe ea gai-1 e kopantsoeng le VENUS (moleng oa pCUC2:: gai-1-VENUS). Ka SAM ea mofuta o hlaha, motlatsi oa CUC2 o khanna polelo ea boholo ba IPR ho SAM, ho kenyelletsa le lisele tsa moeli, ho tloha P4 ho ea pele, 'me polelo e tšoanang e tobileng e ile ea hlokomeloa pCUC2 :: gai-1-VENUS limela (sheba ka tlase). Kabo ea li-angles tsa karohano ea lisele ho pholletsa le SAM kapa IPR ea pCUC2 :: limela tsa gai-1-VENUS li ne li sa fapane haholo le tsa mofuta o hlaha, le hoja ka tšohanyetso re ile ra fumana hore lisele tse se nang IPR limela tsena li arotsoe ka lebelo le phahameng la 80-90 ° (Setšoantšo sa 6f-j).
Ho 'nile ha etsoa tlhahiso ea hore tataiso ea karohano ea lisele e itšetlehile ka geometry ea SAM, haholo-holo khatello ea kelello e hlahisoang ke curvature ea lisele46. Ka hona re ile ra botsa hore na sebopeho sa SAM se fetotsoe ho della global mutant le pCUC2:: gai-1-VENUS limela. Joalokaha ho tlalehiloe pejana12, boholo ba della global mutant SAM bo ne bo le boholo ho feta ba mofuta o hlaha (Supplementary Fig. 13a, b, d). In situ hybridization ea CLV3 le STM RNA e tiisitse ho atolosoa ha meristem ho della mutants le ho tsoela pele ho bontša katoloso ea lateral ea stem cell niche (Supplementary Fig. 13e, f, h, i). Leha ho le joalo, SAM curvature e ne e tšoana le li-genotypes ka bobeli (Supplementary Fig. 13k, m, n, p). Re bone keketseho e tšoanang ea boholo ba gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant ntle le phetoho ea curvature ha e bapisoa le mofuta o hlaha (Supplementary Fig. 13c, d, g, j, l, o, p). Khafetsa ea ho arohana ha sele e ile ea boela ea ameha ka della quadruple mutant, empa ka tekanyo e fokolang ho feta della monolithic mutant (Supplementary Fig. 12d-f). Phello ena ea litekanyetso, hammoho le ho haella ha phello ho curvature, e fana ka maikutlo a hore ts'ebetso e setseng ea RGL3 ho Della quadruple mutant e fokotsa liphetoho tse bakoang ke ho lahleheloa ke mosebetsi oa DELLA le hore liphetoho tsa likarohano tsa lisele tsa lateral li etsahala ka lebaka la liphetoho tsa mosebetsi oa pontšo ea GA ho e-na le liphetoho ho SAM geometry. Joalokaha ho hlalositsoe ka holimo, motlatsi oa CUC2 o khanna polelo ea IPR ho SAM ho qala ka P4 (Supplementary Fig. 14a, b), 'me ka lehlakoreng le leng, pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM e ne e e-na le boholo bo fokotsehileng empa sekhahla se phahameng (Supplementary Fig. 14c-h). Phetoho ena ho pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM morphology e ka 'na ea fella ka kabo e fapaneng ea likhatello tsa mochine ha li bapisoa le mofuta o hlaha, moo khatello e phahameng ea potoloho e qalang ho tloha sebakeng se sekhutšoanyane ho tloha setsing sa SAM47. Ntle le moo, liphetoho tsa pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM morphology li ka bakoa ke liphetoho tsa thepa ea mechine ea libaka e bakoang ke transgene expression48. Maemong ana ka bobeli, sena se ka fokotsa ka mokhoa o itseng litlamorao tsa ho fetoha ha matšoao a GA ka ho eketsa monyetla oa hore lisele li arohane ho pota-pota / ka tsela e fapaneng, ho hlalosa seo re se boneng.
Ha re kopane, lintlha tsa rona li tiisa hore pontšo e phahameng ea GA e bapala karolo e sebetsang ho lateral ea sefofane sa karohano ea lisele ho IPR. Li boetse li bonts'a hore meristem curvature e boetse e susumetsa tsela eo sefofane se arolang lisele ka har'a IPR ka sona.
Mokhoa o fapaneng oa sefofane sa karohano ho IPR, ka lebaka la ts'ebetso e phahameng ea GA, e fana ka maikutlo a hore GA e hlophisa esale pele faele ea sele ea radial ka har'a epidermis ka har'a SAM ho hlalosa mokhatlo oa cellular oo hamorao o tla fumanoa ho epidermal internode. Ka sebele, lifaele tse joalo tsa lisele li ne li atisa ho bonahala litšoantšong tsa SAM tsa della global mutants (Setšoantšo sa 6b). Kahoo, ho tsoela pele ho hlahloba ts'ebetso ea nts'etsopele ea mokhoa oa sebaka sa pontšo ea GA ho SAM, re sebelisitse litšoantšo tsa nako e telele ho hlahloba mokhatlo oa sebaka sa lisele tsa IPR ka mefuta e hlaha (Ler le Col-0), della global mutants, le pCUC2 :: gai-1-VENUS limela tsa transgenic.
Re fumane hore qmRGA e bontšitse hore ts'ebetso ea GA ea pontšo ho IPR e eketsehile ho tloha P1 / P2 'me e fihlile tlhōrōng ea P4,' me mohlala ona o ile oa lula o le teng ka mor'a nako (Fig. 4a-f le Supplementary Fig. 8c-f, k). Ho hlahloba mokhatlo oa sebaka sa lisele tsa IPR ka pontšo ea GA e ntseng e eketseha, re ile ra ngola lisele tsa Ler IPR ka holimo le mahlakoreng a P4 ho ea ka tsoelo-pele ea bona e hlahlobiloeng 34 h ka mor'a ho shebella pele, ke hore, ka makhetlo a fetang a mabeli a plastid, a re lumellang ho latela lisele tsa IPR nakong ea tsoelo-pele ea pele ho tloha P1 / P2 ho ea ho P4. Re ne re sebelisa mebala e meraro e fapaneng: e mosehla bakeng sa lisele tse neng li kopantsoe le primordium haufi le P4, tse tala bakeng sa ba neng ba le IPR, le pherese bakeng sa ba ileng ba kenya letsoho lits'ebetsong ka bobeli (setšoantšo sa 7a-c). Ho t0 (0 h), likarolo tsa 1-2 tsa lisele tsa IPR li ne li bonahala ka pel'a P4 (setšoantšo sa 7a). Joalokaha ho ne ho lebeletsoe, ha lisele tsena li arohana, li ile tsa etsa joalo haholo-holo ka sefofane sa karohano se pota-potileng (Setšoantšo sa 7a-c). Liphetho tse tšoanang li ile tsa fumanoa ho sebelisoa Col-0 SAM (e shebaneng le P3, eo moeli oa eona o kenang ka tsela e tšoanang le P4 ka Ler), le hoja ho genotype ena lesaka le entsoeng moeling oa lipalesa le patile lisele tsa IPR ka potlako (Fig. 7g-i). Kahoo, mokhoa oa karohano oa lisele tsa IPR o hlophisa lisele esale pele ka mela ea radial, joalo ka li-internodes. Ho hlophisoa ha mela ea radial le ho kenya lisele tsa IPR sebakeng pakeng tsa litho tse latellanang li fana ka maikutlo a hore lisele tsena ke li-internodal progenitors.
Mona, re thehile ratiometric GA signing biosensor, qmRGA, e lumellang 'mapa oa bongata ba ts'ebetso ea ho bonts'a GA e hlahisoang ke likhakanyo tse kopaneng tsa GA le GA receptor ha re ntse re fokotsa tšitiso ea litsela tsa matšoao a endogenous, ka hona e fana ka tlhahisoleseling mabapi le ts'ebetso ea GA maemong a cellular. Ho fihlela sena, re thehile protheine e fetotsoeng ea DELLA, mRGA, e lahlehetsoeng ke bokhoni ba ho tlama balekane ba tšebelisano ea DELLA empa e ntse e ela hloko proteolysis e bakoang ke GA. qmRGA e arabela liphetohong tse sa tloaelehang le tse sa feleng maemong a GA, 'me thepa ea eona ea kutlo e matla e thusa ho lekola liphetoho tsa sebaka sa tšebetso ea lipontšo tsa GA nakong ea nts'etsopele. qmRGA hape ke sesebelisoa se tenyetsehang haholo kaha se ka ikamahanya le li-tissue tse fapaneng ka ho fetola motšehetsi ea sebelisitsoeng bakeng sa polelo ea sona (ha ho hlokahala), le ho fuoa sebopeho se bolokehileng sa tsela ea matšoao a GA le sepheo sa PFYRE ho pholletsa le li-angiosperms, e kanna ea fetisetsoa ho mefuta e meng22. Tumellanong le sena, phetoho e lekanang le protheine ea SLR1 DELLA ea raese (HYY497AAA) le eona e bontšitsoe ho hatella ts'ebetso ea khatello ea kholo ea SLR1 ha e ntse e fokotsa ho senyeha ha eona ha GA-mediated, joalo ka mRGA23. Haholo-holo, lithuto tsa morao-rao ho Arabidopsis li bonts'itse hore phetoho e le 'ngoe ea amino acid sebakeng sa PFYRE (S474L) e fetotse ts'ebetso ea mongolo oa RGA ntle le ho ama bokhoni ba eona ba ho sebelisana le balekane ba transcription factor50. Leha phetoho ena e le haufi haholo le li-substitutes tsa 3 tsa amino acid tse teng ho mRGA, lithuto tsa rona li bonts'a hore liphetoho tsena tse peli li fetola litšobotsi tse fapaneng tsa DELLA. Leha boholo ba balekane ba transcription factor ba tlama ho LHR1 le SAW domains tsa DELLA26,51, li-amino acid tse bolokiloeng sebakeng sa PFYRE li ka thusa ho tsitsisa litšebelisano tsena.
Ntlafatso ea Internode ke tšobotsi e ka sehloohong ea meralo ea limela le ntlafatso ea chai. qmRGA e senotse ts'ebetso e phahameng ea GA ho lisele tsa progenitor tsa IPR internode. Ka ho kopanya litšoantšo tse ngata le liphatsa tsa lefutso, re bontšitse hore mekhoa ea lipontšo tsa GA e phahamisa lifofane tse pota-potileng / tse fapaneng ka har'a SAM epidermis, ho bōpa mokhatlo o hlophisitsoeng oa karohano ea lisele o hlokahalang bakeng sa nts'etsopele ea internode. Litaolo tse 'maloa tsa tataiso ea lifofane tsa karohano ea lisele li khethiloe nakong ea nts'etsopele52,53. Mosebetsi oa rona o fana ka mohlala o hlakileng oa kamoo ts'ebetso ea GA e laolang paramente ena ea cellular. DELLA e ka sebelisana le protheine complexes41, kahoo pontšo ea GA e ka laola mokhoa oa sefofane sa karohano ea lisele ka ho susumetsa ka ho toba cortical microtubule orientation40,41,54,55. Re ile ra bontša re sa lebella hore SAM, correlate ea mosebetsi o phahameng oa pontšo ea GA e ne e se selelele kapa karohano ea sele, empa ke anisotropy ea kholo feela, e lumellanang le phello e tobileng ea GA mabapi le tataiso ea karohano ea lisele ho IPR. Leha ho le joalo, re ke ke ra qhelela ka thōko hore phello ena e ka boela ea e-ba e sa tobang, ka mohlala, e kentsoeng ke GA-induced cell wall softening56. Liphetoho tsa thepa ea lerako la lisele li etsa hore ho be le khatello ea mechine57,58, e ka boela ea susumetsa mokhoa oa ho tsamaisa sefofane sa karohano ea lisele ka ho ama mokhoa oa li-cortical microtubules39,46,59. Liphello tse kopantsoeng tsa GA-induced mechanical stress le taolo e tobileng ea microtubule orientation ke GA e ka 'na ea ameha ho hlahiseng mokhoa o itseng oa ho arola lisele ho IPR ho hlalosa li-internodes,' me lithuto tse ling li hlokahala ho hlahloba khopolo ena. Ka mokhoa o ts'oanang, liphuputso tse fetileng li totobalitse bohlokoa ba liprotheine tsa DELLA-interacting TCP14 le 15 taolong ea internode formation60,61 'me lintlha tsena li ka' na tsa kopanya ketso ea GA hammoho le BREVIPEDICELLUS (BP) le PENNYWISE (PNY), e laolang tsoelo-pele ea internode 'me e bontšitsoe ho susumetsa pontšo ea 2 GA. Kaha DELLAs e sebelisana le brassinosteroid, ethylene, jasmonic acid, le abscisic acid (ABA) e bontšang litsela63,64 le hore lihomone tsena li ka susumetsa microtubule orientation65, liphello tsa GA mabapi le ho arohana ha sele li ka boela tsa kopanngoa ke lihomone tse ling.
Liphuputso tsa pele tsa cytological li bontšitse hore libaka tse ka hare le tse ka ntle tsa Arabidopsis SAM li hlokahala bakeng sa nts'etsopele ea internode2,42. Taba ea hore GA e laola ka mafolofolo karohano ea lisele ka har'a lisele tse ka hare12 e ts'ehetsa ts'ebetso e 'meli ea GA ho laola meristem le boholo ba internode ho SAM. Mokhoa oa karohano ea lisele tse tataisoang o boetse o laoloa ka thata ka har'a lisele tse ka hare tsa SAM, 'me molao ona o bohlokoa bakeng sa kholo ea stem52. Ho tla ba monate ho hlahloba hore na GA e boetse e bapala karolo ea ho tsamaisa sefofane sa karohano ea lisele mokhatlong o ka hare oa SAM, ka hona ho hokahanya litlhaloso le nts'etsopele ea li-internode ka har'a SAM.
Limela li ne li lengoa ka hare ho mobu kapa 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) e tlatsitsoeng ka 1% sucrose le 1% agar (Sigma) tlas'a maemo a tloaelehileng (leseli la 16, 22 °C), ntle le liteko tsa hypocotyl le tsa ho hōla ha metso moo lipeo li neng li lengoa holim'a lipoleiti tse otlolohileng tlas'a khanya e sa feleng ea 2 ° C le 2 ° C. Bakeng sa liteko tsa nitrate, limela li ile tsa lengoa ho MS medium e fetotsoeng (bioWORLD plant medium) e tlatsitsoeng ka nitrate e lekaneng (0 kapa 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% sucrose le 1% A-agar (Sigma) tlas'a maemo a letsatsi le lelelele.
GID1a cDNA e kentsoeng ho pDONR221 e ile ea kopanngoa hape le pDONR P4-P1R-pUBQ10 le pDONR P2R-P3-mCherry ho pB7m34GW ho hlahisa pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNA e kentsoeng ho pDONR221 e ile ea kopanngoa hape ho pB7RWG266 ho hlahisa p35S:IDD2-RFP. Ho hlahisa pGID1b::2xmTQ2-GID1b, sekhechana sa 3.9 kb holimo ho sebaka sa likhoutu tsa GID1b le sekhechana sa 4.7 kb se nang le GID1b cDNA (1.3 kb) le terminator (3.4 kb) li ile tsa qala ho holisoa ka ho sebelisa li-primer ho 3 Supplementary p-R4 (Thermo Fisher Scientific) le pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), ka ho latellana, 'me qetellong li kopantsoe hape le pDONR221 2xmTQ268 ho pGreen 012567 target vector sebelisa Gateway cloning. Ho hlahisa pCUC2::LSSmOrange, CUC2 promotor tatelano (3229 bp hodimo ho ATG) e latelwang ke tatellano ya dikhoutu ya Stokes-shifted mOrange e kgolo (LSSmOrange)69 ka letshwao la N7 la nyutlelie la N7 le transcriptional terminator ya NOS di ne di kopantswe ka har'a tsamaiso ya "Green" kapa "Green". (Invitrogen). Semela sa binary vector se ile sa hlahisoa ho Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 mme sa kenngoa ka har'a makhasi a Nicotiana benthamiana ka mokhoa oa ho kenella oa Agrobacterium le ho Arabidopsis thaliana Col-0 ka mokhoa oa ho qoelisa lipalesa, ka ho latellana. pUBQ10 :: qmRGA pUBQ10 :: GID1a-mCherry le pCLV3 :: mCherry-NLS qmRGA li ne li khethiloe ho tloha ho F3 le F1 meloko ea lifapano tse fapaneng, ka ho latellana.
RNA in situ hybridization e entsoe ho hoo e ka bang 1 cm ea malelele a malelele a malelele a tips72, a ileng a bokelloa 'me hang-hang a kenngoa ka tharollo ea FAA (3.7% formaldehyde, 5% acetic acid, 50% ethanol) e pholileng pele ho 4 °C. Kamora kalafo ea vacuum ea 2 × 15 min, fixative e ile ea fetoloa mme lisampole li ile tsa kenngoa bosiu bo le bong. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, le RGL3 cDNAs le li-antisense probes ho li-3'-UTR tsa tsona li ile tsa etsoa ho sebelisoa li-primers tse bontšitsoeng ho Supplementary Table 3 joalokaha ho hlalositsoe ke Rosier et al.73. Li-probe tse ngotsoeng ka Digoxigenin li ile tsa sibolloa ka ho sebelisa lithibela-mafu tsa digoxigenin (ho hlapolloa ka makhetlo a 3000; Roche, nomoro ea lethathamo: 11 093 274 910), 'me likarolo li ne li silafalitsoe ka 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, 250-diblueNutrolution), 200-fold dilution) tharollo.
Nako ea poso: Feb-10-2025