Kgolo ya apical meristem ya letlobo (SAM) e bohlokwa bakeng sa meralo ya kutu.li-gibberellin(GAs) di bapala karolo ya bohlokwa ho hokahanya kgolo ya dimela, empa karolo ya tsona ho SAM e ntse e sa utlwisisehe hantle. Mona, re ntsheditse pele biosensor ya ratiometric ya GA signaling ka ho etsa protheine ya DELLA ho thibela mosebetsi wa yona wa bohlokwa wa taolo karabelong ya GA transcriptional ha re ntse re boloka ho senyeha ha yona ha ho ananelwa GA. Re bontsha hore biosensor ena e thehilweng tshenyehong e tlaleha ka nepo diphetoho maemong a GA le kutlo ya sele nakong ya ntshetsopele. Re sebedisitse biosensor ena ho etsa mapa wa mosebetsi wa GA signaling ho SAM. Re bontsha hore matshwao a phahameng a GA a teng haholoholo diseleng tse pakeng tsa di-primordia tsa ditho, e leng dipelela tsa disele tsa internode. Re sebedisa mekgwa ya ho fumana le ho lahlehelwa ke mosebetsi, re bontsha hape hore GA e laola tataiso ya sefofane sa karohano ya sele, e theha mokgahlelo wa sele wa canonical wa di-internode, ka hona e kgothaletsa tlhaloso ya internode ho SAM.
Meristem ea apical ea letlobo (SAM), e fumanehang ntlheng ea letlobo, e na le sebaka sa lisele tsa kutu tseo mosebetsi oa tsona o hlahisang litho tse ka thoko le li-node tsa kutu ka mokhoa oa modular le o pheta-phetoang bophelong bohle ba semela. E 'ngoe le e 'ngoe ea li-unit tsena tse pheta-phetoang, kapa li-node tsa semela, e kenyelletsa li-internode le litho tse ka thoko li-node, le li-meristem tsa axillary li-axils tsa lekhasi1. Kholo le tlhophiso ea li-node tsa semela lia fetoha nakong ea nts'etsopele. Ho Arabidopsis, kholo ea li-internodal e hatelloa nakong ea mohato oa limela, 'me li-meristem tsa axillary li lula li robetse li-axils tsa makhasi a rosette. Nakong ea phetoho ho ea mohatong oa lipalesa, SAM e fetoha meristem ea inflorescence, e hlahisang li-internode tse telele le li-buds tsa axillary, makala a manyenyane li-axils tsa makhasi a cauline, 'me hamorao, lipalesa tse se nang makhasi2. Le hoja re entse tsoelo-pele e kholo ho utloisiseng mekhoa e laolang ho qalisoa ha makhasi, lipalesa le makala, ho tsejoa hanyane ka hanyane ka hore na li-internode li hlaha joang.
Ho utloisisa kabo ea GAs sebakeng se itseng ho tla thusa ho utloisisa hamolemo mesebetsi ea lihormone tsena liseleng tse fapaneng le mehatong e fapaneng ea nts'etsopele. Pono ea ho senyeha ha motsoako oa RGA-GFP o hlahisoang tlas'a ts'ebetso ea promoter ea eona e fana ka tlhahisoleseling ea bohlokoa mabapi le taolo ea maemo ohle a GA metsong15,16. Leha ho le joalo, polelo ea RGA e fapana ho pholletsa le lisele17 'me e laoloa ke GA18. Kahoo, polelo e fapaneng ea promoter ea RGA e ka fella ka mokhoa oa fluorescence o bonoang ka RGA-GFP 'me kahoo mokhoa ona ha o na bongata. Haufinyane tjena, GA19,20 e nang le fluorescein (Fl) e senotse ho bokellana ha GA ka har'a endocortex ea motso le taolo ea maemo a eona a sele ka lipalangoang tsa GA. Haufinyane tjena, sensor ea GA FRET nlsGPS1 e bontšitse hore maemo a GA a amana le ho hola ha sele metsong, li-filament le li-hypocotyls tse holileng lefifi21. Leha ho le joalo, joalo ka ha re bone, mahloriso a GA ha se eona feela paramethara e laolang ts'ebetso ea ho supa ea GA, kaha e itšetlehile ka lits'ebetso tse rarahaneng tsa ho lemoha. Mona, re haha hodima kutlwisiso ya rona ya ditsela tsa ho bontsha tsa DELLA le GA, re tlaleha ntshetsopele le tlhaloso ya biosensor e thehilweng ho degradation-based ratiometric biosensor bakeng sa GA signaling. Ho ntshetsa pele biosensor ena ya bongata, re sebedisitse RGA e fetotsweng e utlwang GA e neng e kopantswe le protheine e fluorescent mme e hlahiswa hohle dinama, hammoho le protheine e fluorescent e sa utlweng GA. Re bontsha hore ho kopana ha protheine ya RGA e fetotsweng ha ho sitise ho bontsha ha GA ha tlhaho ha ho hlahiswa hohle, le hore biosensor ena e ka lekanya mosebetsi wa ho bontsha o hlahang ho kenngwa ha GA le ho sebetswa ha letshwao la GA ke sesebediswa sa ho utlwa se nang le qeto e phahameng ya sebaka. Re sebedisitse biosensor ena ho etsa mmapa wa kabo ya sebaka ya mosebetsi wa ho bontsha wa GA le ho lekanya kamoo GA e laolang boitshwaro ba sele ka hara epidermis ya SAM. Re bontsha hore GA e laola tataiso ya sefofane sa karohano ya disele tsa SAM tse pakeng tsa di-primordia tsa setho, ka hona re hlalosa mokgahlelo wa sele wa canonical wa internode.
Qetellong, re ile ra botsa hore na qmRGA e ka tlaleha diphetoho maemong a GA a tlhaho re sebedisa di-hypocotyls tse ntseng di hola. Re kile ra bontsha hore nitrate e hlohlelletsa kgolo ka ho eketsa tlhahiso ya GA mme, ka lehlakoreng le leng, ho senyeha ha DELLA34. Ka hona, re bone hore bolelele ba hypocotyl ho dipeo tsa pUBQ10::qmRGA tse hodisitsweng tlasa phepelo e ngata ya nitrate (10 mM NO3−) bo ne bo le bolelele haholo ho feta ba dipeo tse hodisitsweng tlasa maemo a haellang nitrate (Setshwantsho se Tlatsetsang sa 6a). Ho ya ka karabelo ya kgolo, matshwao a GA a ne a le hodimo ho di-hypocotyls tsa dipeo tse hodisitsweng tlasa maemo a 10 mM NO3− ho feta dipeo tse hodisitsweng ha ho se na nitrate (Setshwantsho se Tlatsetsang sa 6b, c). Kahoo, qmRGA e boetse e nolofalletsa ho beha leihlo diphetoho ho tshwaetso ya GA e bakwang ke diphetoho tsa tlhaho ho mahloriso a GA.
Ho utloisisa hore na mosebetsi oa lipontšo tsa GA o fumanoeng ke qmRGA o itšetlehile ka mahloriso a GA le kutloisiso ea GA, joalo ka ha ho ne ho lebelletsoe ho latela moralo oa sensor, re hlahlobile polelo ea li-receptor tse tharo tsa GID1 liseleng tsa limela le tsa ho ikatisa. Lipeong, mola oa litlaleho oa GID1-GUS o bontšitse hore GID1a le c li ne li hlahisoa haholo ho li-cotyledon (Setšoantšo sa 3a–c). Ho phaella moo, li-receptor tsohle tse tharo li ne li hlahisoa makhasing, primordia ea motso o ka thoko, lintlheng tsa motso (ntle le sekoahelo sa motso sa GID1b), le tsamaiso ea methapo ea mali (Setšoantšo sa 3a–c). Ho SAM ea inflorescence, re ile ra lemoha matšoao a GUS feela bakeng sa GID1b le 1c (Setšoantšo sa Tlatsetso sa 7a–c). Ho kopanya ha In situ ho tiisitse mekhoa ena ea polelo 'me ha boela ha bontšoa hore GID1c e ne e hlahisoa ka ho lekana maemong a tlase ho SAM, athe GID1b e ne e bontša tlhahiso e phahameng moeling oa SAM (Setšoantšo sa Tlatsetso sa 7d–l). Ho kopanngoa ha phetolelo ya pGID1b::2xmTQ2-GID1b ho boetse ho senotse mefuta e fapaneng ya tlhahiso ya GID1b, ho tloha tlhahisong e tlase kapa e se nang letho bohareng ba SAM ho ya tlhahisong e phahameng meeding ya ditho (Setshwantsho se Tlatsetsang sa 7m). Kahoo, di-receptor tsa GID1 ha di arolwe ka ho lekana ho pholletsa le dinama le ka hare ho dinama. Ditekong tse latelang, re boetse ra hlokomela hore tlhahiso e feteletseng ya GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) e ekeditse kutlwisiso ya qmRGA ho di-hypocotyls ho ya tshebedisong ya GA ya kantle (Setshwantsho sa 3d, e). Ka lehlakoreng le leng, fluorescence e lekantsweng ka qd17mRGA ho hypocotyl e ne e sa amehe kalafong ya GA3 (Setshwantsho sa 3f, g). Bakeng sa diteko ka bobedi, dipeo di ile tsa phekolwa ka maemo a hodimo a GA (100 μM GA3) ho lekola boitshwaro bo potlakileng ba sensor, moo bokgoni ba ho tlama ho receptor ya GID1 bo ileng ba ntlafala kapa ba lahleha. Hammoho, liphetho tsena li tiisa hore qmRGA biosensor e sebetsa ka kopanelo e le sensor ea GA le GA, 'me li fana ka maikutlo a hore tlhahiso e fapaneng ea receptor ea GID1 e ka fetola haholo ho ntšoa ha sensor.
Ho fihlela jwale, kabo ya matshwao a GA ho SAM e ntse e sa hlaka. Ka hona, re sebedisitse dimela tse hlahisang qmRGA le reporter ya sele ya motheo ya pCLV3::mCherry-NLS35 ho bala dimmapa tsa bongata tse nang le qeto e hodimo ya mosebetsi wa ho bontsha GA, re tsepamisitse maikutlo hodima lera la L1 (epidermis; Setshwantsho sa 4a, b, bona Mekgwa le Mekgwa e Tlatsetsang), kaha L1 e bapala karolo ya bohlokwa ho laoleng kgolo ya SAM36. Mona, pontsho ya pCLV3::mCherry-NLS e fane ka ntlha ya referense e tsitsitseng ya jeometri bakeng sa ho sekaseka kabo ya sebaka sa mosebetsi wa ho bontsha GA37. Le hoja GA e nkwa e le ya bohlokwa bakeng sa ntshetsopele ya ditho tse ka thoko4, re hlokometse hore matshwao a GA a ne a le tlase ho primordium ya dipalesa (P) ho qala ho tloha mohatong wa P3 (Setshwantsho sa 4a, b), athe primordium tse nyane tsa P1 le P2 di ne di na le mosebetsi o itekanetseng o tshwanang le o sebakeng se bohareng (Setshwantsho sa 4a, b). Mosebetsi o phahameng oa ho supa GA o fumanoe meeling ea primordium ea litho, ho qala ho P1/P2 (mahlakoreng a moeli) le ho fihla sehlohlolong ho P4, hammoho le liseleng tsohle tsa sebaka se ka thoko se pakeng tsa primordia (Setšoantšo sa 4a, b le Setšoantšo se Tlatsetsang sa 8a, b). Mosebetsi ona o phahameng oa ho supa GA o bonoe eseng feela ka har'a epidermis empa hape le ka har'a L2 le likarolo tse ka holimo tsa L3 (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 8b). Paterone ea matšoao a GA a fumanoeng ho SAM ho sebelisoa qmRGA le eona e ile ea lula e sa fetohe ha nako e ntse e ea (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 8c–f, k). Leha kaho ea qd17mRGA e ile ea fokotsoa ka mokhoa o hlophisehileng ho SAM ea limela tsa T3 ho tsoa meleng e mehlano e ikemetseng eo re e hlalositseng ka botlalo, re ile ra khona ho sekaseka mekhoa ea fluorescence e fumanoeng ka kaho ea pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 8g–j, l). Moleng ona oa taolo, ho fumanoe liphetoho tse nyane feela karolelanong ea fluorescence ho SAM, empa setsing sa SAM re bone phokotso e hlakileng le e sa lebelloang ho VENUS e amanang le TagBFP. Sena se tiisa hore mokhoa oa ho supa o bonoang ke qmRGA o bonts'a ho senyeha ho itšetlehileng ka GA ha mRGA-VENUS, empa hape o bontša hore qmRGA e ka 'na ea feteletsa mosebetsi oa ho supa oa GA setsing sa meristem. Ka bokhutšoanyane, liphetho tsa rona li senola mokhoa oa ho supa oa GA o bonts'ang haholo-holo kabo ea primordia. Kabo ena ea sebaka sa lipakeng tsa primordial (IPR) e bakoa ke ho thehoa butle-butle ha mosebetsi o phahameng oa ho supa oa GA pakeng tsa primordium e ntseng e hola le sebaka se bohareng, ha ka nako e ts'oanang mosebetsi oa ho supa oa GA ho primordium o fokotseha (Setšoantšo sa 4c, d).
Kabo ea li-receptor tsa GID1b le GID1c (sheba kaholimo) e fana ka maikutlo a hore tlhahiso e fapaneng ea li-receptor tsa GA e thusa ho bopa mohlala oa ts'ebetso ea lipontšo tsa GA ho SAM. Re ile ra ipotsa hore na pokello e fapaneng ea GA e ka 'na ea ameha. Ho batlisisa monyetla ona, re sebelisitse sensor ea nlsGPS1 GA FRET21. Ho eketseha ha maqhubu a ts'ebetso ho ile ha fumanoa ho SAM ea nlsGPS1 e phekoloang ka 10 μM GA4+7 metsotso e 100 (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 9a–e), se bontšang hore nlsGPS1 e arabela liphetohong tsa mahloriso a GA ho SAM, joalo ka ha e etsa metsong21. Kabo ea sebaka sa maqhubu a ts'ebetso ea nlsGPS1 e senotse maemo a GA a tlase haholo likarolong tse ka ntle tsa SAM, empa e bontšitse hore a ne a phahame bohareng le meeling ea SAM (Setšoantšo sa 4e le Setšoantšo se Tlatsetsang sa 9a,c). Sena se fana ka maikutlo a hore GA e boetse e ajoa ho SAM ka mokhoa oa sebaka o tšoanang le o senotsoeng ke qmRGA. Jwalo ka mokgwa o tlatsanang, re boetse ra tshwara SAM ka GA e phatsimang (GA3-, GA4-, GA7-Fl) kapa Fl feela e le taolo e mpe. Letshwao la Fl le ile la ajwa ho pholletsa le SAM, ho kenyeletswa le sebaka se bohareng le primordium, leha e le ka matla a tlase (Setshwantsho sa 4j le Setshwantsho se Tlatsetsang sa 10d). Ka lehlakoreng le leng, GA-Fl tsohle tse tharo di ile tsa bokellana ka ho kgetheha ka hara meedi ya primordium le ho isa maemong a fapaneng karolong e setseng ya IPR, mme GA7-Fl e bokellana sebakeng se seholo ka ho fetisisa ho IPR (Setshwantsho sa 4k le Setshwantsho se Tlatsetsang sa 10a,b). Palo ya matla a fluorescence e senotse hore karolelano ya matla a IPR ho a seng a IPR e ne e le hodimo ho SAM e phekotsweng ke GA-Fl ha e bapiswa le SAM e phekotsweng ke Fl (Setshwantsho sa 4l le Setshwantsho se Tlatsetsang sa 10c). Hammoho, diphetho tsena di bontsha hore GA e teng maemong a hodimo diseleng tsa IPR tse haufi le moedi wa ditho. Sena se fana ka maikutlo a hore mohlala oa ts'ebetso ea lipontšo tsa SAM GA o bakoa ke tlhahiso e fapaneng ea li-receptor tsa GA le pokello e fapaneng ea GA liseleng tsa IPR haufi le meeli ea litho. Kahoo, tlhahlobo ea rona e senotse mohlala o sa lebelloang oa sebaka sa lipontšo tsa GA, ka ts'ebetso e tlase bohareng le qalong ea SAM le ts'ebetso e phahameng ho IPR sebakeng se ka thoko.
Ho utloisisa karolo ea mosebetsi oa lipontšo tsa GA tse fapaneng ho SAM, re hlahlobile kamano pakeng tsa mosebetsi oa lipontšo tsa GA, katoloso ea sele, le karohano ea sele re sebelisa setšoantšo sa nako ea sebele sa SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Ka lebaka la karolo ea GA taolong ea kholo, ho ne ho lebelletsoe kamano e ntle le liparamente tsa katoloso ea sele. Ka hona, re ile ra qala ka ho bapisa limmapa tsa mesebetsi ea lipontšo tsa GA le limmapa tsa sekhahla sa kholo ea bokaholimo ba sele (e le moemeli oa matla a katoloso ea sele bakeng sa sele e fanoeng le bakeng sa lisele tsa morali karohanong) le limmapa tsa anisotropy ea kholo, e lekanyang tataiso ea katoloso ea sele (e boetse e sebelisoa mona bakeng sa sele e fanoeng le bakeng sa lisele tsa morali karohanong; Setšoantšo sa 5a,b, bona Mekhoa le Mekhoa e Eketsehileng). Limmapa tsa rona tsa sekhahla sa kholo ea bokaholimo ba sele ea SAM li lumellana le lintho tse hlokometsoeng pejana38,39, ka sekhahla se fokolang sa kholo moeling le sekhahla se phahameng sa kholo lipalesa tse ntseng li hola (Setšoantšo sa 5a). Tlhahlobo ea likarolo tse ka sehloohong (PCA) e bontšitse hore mosebetsi oa lipontšo tsa GA o ne o amana hampe le matla a kholo ea bokaholimo ba sele (Setšoantšo sa 5c). Re boetse re bontšitse hore li-axes tse kholo tsa phapang, ho kenyeletsoa le ho kenngoa ha lipontšo tsa GA le matla a kholo, li ne li le ka lehlakoreng le khethiloeng ke polelo e phahameng ea CLV3, e leng se tiisang ho tlosoa ha lisele setsing sa SAM litlhahlobong tse setseng. Tlhahlobo ea kamano ea Spearman e tiisitse liphetho tsa PCA (Setšoantšo sa 5d), e bontšang hore matšoao a phahameng a GA ho IPR ha aa ka a fella ka katoloso e phahameng ea sele. Leha ho le joalo, tlhahlobo ea kamano e senotse kamano e nyane e ntle pakeng tsa ts'ebetso ea lipontšo tsa GA le anisotropy ea kholo (Setšoantšo sa 5c, d), e leng se bontšang hore matšoao a phahameng a GA ho IPR a susumetsa tataiso ea kholo ea sele le mohlomong boemo ba sefofane sa karohano ea sele.
a, b Limmapa tsa mocheso tsa kgolo e mahareng ya bokaholimo (a) le anisotropy ya kgolo (b) ho SAM di ne di lekana ka karolelano ho feta dimela tse supileng tse ikemetseng (tse sebediswang e le diproksi bakeng sa matla le tataiso ya katoloso ya sele, ka ho latellana). c Tlhahlobo ya PCA e ne e kenyelletsa diphetoho tse latelang: letshwao la GA, matla a kgolo ya bokaholimo, anisotropy ya kgolo ya bokaholimo, le polelo ya CLV3. Karolo ya PCA 1 e ne e amana haholo le matla a kgolo ya bokaholimo mme e amana hantle le letshwao la GA. Karolo ya PCA 2 e ne e amana haholo le anisotropy ya kgolo ya bokaholimo mme e amana hampe le polelo ya CLV3. Diperesente di emela phapang e hlalositsweng ke karolo ka nngwe. d Tlhahlobo ya kamano ya Spearman pakeng tsa letshwao la GA, matla a kgolo ya bokaholimo, le anisotropy ya kgolo ya bokaholimo sekaleng sa dinama ntle le CZ. Nomoro e ka ho le letona ke boleng ba Spearman rho pakeng tsa diphetoho tse pedi. Di-asterisk di bontsha maemo ao kamano/kamano e mpe e leng ya bohlokwa haholo. e Ponahalo ya 3D ya disele tsa Col-0 SAM L1 ka microscopy ya confocal. Mabota a matjha a sele a bopilweng ho SAM (empa eseng primordium) ka dihora tse 10 a mmala ho ya ka boleng ba ona ba angle. Mohala oa 'mala o bontšitsoe sekhutlong se ka tlase ho le letona. Karolo e ka hare e bontša setšoantšo se tsamaellanang sa 3D ka hora ea 0. Teko e phetiloe habeli ka liphetho tse tšoanang. f Lipolane tsa lebokose li bontša sekhahla sa karohano ea sele ho IPR le non-IPR Col-0 SAM (n = limela tse ikemetseng tse 10). Mohala o bohareng o bontša bohareng, 'me meeli ea lebokose e bontša liphesente tsa 25 le 75. Litelu li bontša boleng bo tlase le bo phahameng bo khethiloeng ka software ea R. Boleng ba P bo fumanoe ka teko ea t-e nang le mehatla e 'meli ea Welch. g, h Setšoantšo sa Schematic se bontšang (g) mokhoa oa ho lekanya sekhutlo sa lebota le lecha la sele (magenta) mabapi le tataiso ea radial ho tloha bohareng ba SAM (mola o mosoeu o nang le matheba) (ke hore, boleng ba sekhutlo se bohale feela, ke hore, 0–90°, bo nahanoa), le (h) litaelo tsa potoloho/mahlakore le radial ka har'a meristem. i Li-histogram tsa maqhubu a tataiso ea sefofane sa karohano ea sele ho pholletsa le SAM (boputsoa bo lefifi), IPR (boputsoa bo mahareng), le non-IPR (boputsoa bo bobebe), ka ho latellana. Boleng ba P bo fumanoe ka teko ea Kolmogorov-Smirnov e nang le mehatla e 'meli. Teko e phetiloe habeli ka liphetho tse tšoanang. j Li-histogram tsa maqhubu a tataiso ea sefofane sa karohano ea sele ea IPR ho potoloha P3 (botala bo bobebe), P4 (botala bo mahareng), le P5 (botala bo lefifi), ka ho latellana. Boleng ba P bo fumanoe ka teko ea Kolmogorov-Smirnov e nang le mehatla e 'meli. Teko e phetiloe habeli ka liphetho tse tšoanang.
Ka hona, re ile ra batlisisa kamano pakeng tsa ho supa ha GA le mosebetsi wa karohano ya sele ka ho hlwaya mabota a sa tswa thehwa a sele nakong ya teko (Setshwantsho sa 5e). Mokgwa ona o re dumella ho lekanya maqhubu le tataiso ya karohano ya sele. Ka mokhoa o makatsang, re fumane hore maqhubu a dikarohano tsa sele ho IPR le karolo e setseng ya SAM (e seng ya IPR, Setshwantsho sa 5f) a ne a tshwana, a bontsha hore dipharologanyo tsa ho supa ha GA pakeng tsa disele tsa IPR le tse seng tsa IPR ha di ame karohano ya sele haholo. Sena, le kamano e ntle pakeng tsa ho supa ha GA le anisotropy ya kgolo, di re susumeditse ho nahana hore na mosebetsi wa ho supa ha GA o ka susumetsa tsela eo sefofane sa karohano ya sele se shebaneng ka yona. Re lekantse tsela eo lebota le lecha la sele le shebaneng ka yona e le sekhutlo se matla se amanang le radial axis e hokahanyang setsi sa meristem le setsi sa lebota le lecha la sele (Setshwantsho sa 5e-i) mme ra bona tshekamelo e hlakileng ya hore disele di arohane ka dikhutlo tse haufi le 90° ha di bapiswa le radial axis, ka maqhubu a phahameng ka ho fetisisa a bonweng ho 70–80° (23.28%) le 80–90° (22.62%) (Setshwantsho sa 5e,i), e tsamaellanang le dikarohano tsa disele ka tsela e potolohang/e potolohang (Setshwantsho sa 5h). Ho hlahloba monehelo wa letshwao la GA boitshwarong bona ba karohano ya disele, re sekasekile diparamitha tsa karohano ya disele ho IPR le ho se be IPR ka thoko (Setshwantsho sa 5i). Re hlokometse hore kabo ea sekhutlo sa karohano liseleng tsa IPR e fapane le ea liseleng tse seng tsa IPR kapa liseleng tsa SAM eohle, ka lisele tsa IPR tse bonts'ang karolo e phahameng ea likarohano tsa lisele tse ka thoko/tse chitja, ke hore, 70-80° le 80-90° (33.86% le 30.71%, ka ho latellana, litekanyo tse tsamaellanang) (Setšoantšo sa 5i). Kahoo, lintho tseo re li boneng li senotse kamano pakeng tsa pontšo e phahameng ea GA le tataiso ea sefofane sa karohano ea sele e haufi le tataiso e potolohileng, e tšoanang le kamano pakeng tsa ts'ebetso ea pontšo ea GA le anisotropy ea kholo (Setšoantšo sa 5c, d). Ho theha polokeho ea sebaka sa kamano ena haholoanyane, re lekanyelitse tataiso ea sefofane sa karohano liseleng tsa IPR tse potileng primordium ho qala ho tloha ho P3, kaha ts'ebetso e phahameng ka ho fetisisa ea pontšo ea GA e fumanoe sebakeng sena ho qala ho tloha ho P4 (Setšoantšo sa 4). Likhutlo tsa karohano tsa IPR ho potoloha P3 le P4 ha lia ka tsa bontša liphapang tsa bohlokoa tsa lipalo-palo, leha ho bile le keketseho ea makhetlo a likarohano tsa lisele tse ka thoko ho IPR ho potoloha P4 (Setšoantšo sa 5j). Leha ho le jwalo, diseleng tsa IPR tse potileng P5, phapang tseleng eo sehlopha sa karohano ya sele se shebaneng ka yona e ile ya ba bohlokwa ka dipalopalo, ka keketseho e kgolo ya maqhubu a dikarohano tsa sele tse tshekaletseng (Setshwantsho sa 5j). Mmoho, diphetho tsena di bontsha hore letshwao la GA le ka laola tsela eo dikarohano tsa sele di shebaneng ka yona ho SAM, e leng se tsamaellanang le ditlaleho tse fetileng40,41 tsa hore letshwao le phahameng la GA le ka baka tsela eo dikarohano tsa sele di shebaneng ka yona ho IPR.
Ho boleloa esale pele hore lisele tse ho IPR li ke ke tsa kenyelletsoa ho primordia empa li tla kenngoa ho internode2,42,43. Tsela e tšekaletseng ea likarohano tsa sele ho IPR e ka fella ka tlhophiso e tloaelehileng ea mela e bolelele e bapileng ea lisele tsa epidermal ho internode. Litemoso tsa rona tse hlalositsoeng ka holimo li bontša hore ho ka etsahala hore GA e bapale karolo ts'ebetsong ena ka ho laola tataiso ea karohano ea sele.
Ho lahleheloa ke ts'ebetso ea liphatsa tse 'maloa tsa lefutso tsa DELLA ho fella ka karabelo ea GA e ikemetseng, 'me liphetoho tsa della li ka sebelisoa ho leka khopolo-taba ena44. Re qalile ka ho sekaseka mekhoa ea polelo ea liphatsa tse hlano tsa lefutso tsa DELLA ho SAM. Ho kopanngoa ha mongolo oa GUS line45 ho senotse hore GAI, RGA, RGL1, le RGL2 (ka tekanyo e nyane haholo) li hlahisitsoe ho SAM (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 11a–d). Ho kopanya ha sebaka ho bontšitse hape hore GAI mRNA e bokellana ka ho khetheha lipalesang tsa pele le tse ntseng li hola (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 11e). RGL1 le RGL3 mRNA li fumanoe ho pholletsa le canopy ea SAM le lipalesa tsa khale, athe RGL2 mRNA e ne e le ngata haholo sebakeng sa moeli (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 11f–h). Setšoantšo sa confocal sa pRGL3::RGL3-GFP SAM se tiisitse polelo e bonoang ke ho kopanya ha sebaka sa in situ 'me se bontšitse hore protheine ea RGL3 e bokellana karolong e bohareng ea SAM (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 11i). Re sebelisa mola oa pRGA::GFP-RGA, re boetse ra fumana hore protheine ea RGA e bokellana ho SAM, empa bongata ba eona bo fokotseha moeling ho qala ho tloha ho P4 (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 11j). Haholo-holo, mekhoa ea polelo ea RGL3 le RGA e tsamaellana le ts'ebetso e phahameng ea lipontšo tsa GA ho IPR, joalo ka ha e lemohuoe ke qmRGA (Setšoantšo sa 4). Ho feta moo, lintlha tsena li bontša hore DELLA tsohle li hlahisoa ho SAM le hore polelo ea tsona ka kakaretso e akaretsa SAM eohle.
Ka mor'a moo re ile ra sekaseka liparamente tsa karohano ea sele ho SAM ea mofuta oa tlhaho (Ler, taolo) le li-mutants tsa gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) (Setšoantšo sa 6a, b). Hoa thahasellisa hore re bone phetoho ea bohlokoa ea lipalo-palo kabong ea maqhubu a angle ea karohano ea sele ho SAM ea lefats'e ea della ha e bapisoa le mofuta oa naha (Setšoantšo sa 6c). Phetoho ena ho della global mutant e bakiloe ke keketseho ea maqhubu a li-angle tsa 80-90° (34.71% khahlano le 24.55%) le, ka tekanyo e nyane, li-angle tsa 70-80° (23.78% khahlano le 20.18%), ke hore, tse tsamaellanang le likarohano tsa sele tse potolohang (Setšoantšo sa 6c). Khafetsa ea likarohano tse sa feteleng (0-60°) le eona e ne e le tlase ho della global mutant (Setšoantšo sa 6c). Makgetlo a dikarohano tsa disele tse potileng a eketsehile haholo ho SAM ya della global mutant (Setshwantsho sa 6b). Makgetlo a dikarohano tsa disele tse potileng ho IPR le ona a ne a le hodimo ho della global mutant ha a bapiswa le mofuta wa naha (Setshwantsho sa 6d). Kantle ho sebaka sa IPR, mofuta wa naha o ne o na le kabo e tshwanang ya dikhutlo tsa dikarohano tsa disele, athe della global mutant e ne e rata dikarohano tsa tangential jwalo ka IPR (Setshwantsho sa 6e). Re boetse ra lekanya tsela eo dikarohano tsa disele di leng ka yona ho SAM ya di-mutants tse 50 tsa ga2 oxidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, le ga2ox6-2), semelo sa di-mutant tse sa sebetseng tsa GA seo ho sona GA e bokellanang. Ho ya ka keketseho ya maemo a GA, SAM ya quintuple ga2ox mutant inflorescence e ne e le kgolo ho feta ya Col-0 (Setshwantsho se Tlatsetsang sa 12a, b), mme ha e bapiswa le Col-0, quintuple ga2ox SAM e bontshitse kabo e fapaneng ka ho hlaka ya dikhutlo tsa karohano ya sele, ka maqhubu a angle a eketsehang ho tloha ho 50° ho ya ho 90°, ke hore hape e rata dikarohano tsa tangential (Setshwantsho se Tlatsetsang sa 12a–c). Kahoo, re bontsha hore ho kenngwa tshebetsong ha GA signaling le pokello ya GA ho baka dikarohano tsa sele tse ka thoko ho IPR le karolo e setseng ya SAM.
a, b Pono ea 3D ea lera la L1 la Ler (a) e nang le matheba a PI le della mutant ea lefats'e (b) SAM ho sebelisoa microscopy ea confocal. Mabota a macha a sele a entsoeng ka SAM (empa eseng primordium) nakong ea lihora tse 10 a bontšoa 'me a mebala ho latela boleng ba bona ba sekhutlo. Setšoantšo se ka hare se bontša SAM ka hora ea 0. Mohala oa 'mala o bontšoa sekhutlong se ka tlase se letona. Motsu o ho (b) o supa mohlala oa lifaele tsa sele tse tsamaellanang ho della mutant ea lefats'e. Teko e phetiloe habeli ka liphetho tse tšoanang. ce papiso ea kabo ea makhetlo a tataiso ea sefofane sa karohano ea sele ho SAM eohle (d), IPR (e), le e seng IPR (f) pakeng tsa Ler le della ea lefats'e. Litekanyetso tsa P li fumanoe ho sebelisoa teko ea Kolmogorov-Smirnov e nang le mehatla e 'meli. f, g Pono ea 3D ea litšoantšo tsa confocal tsa SAM e nang le matheba a PI ea limela tsa Col-0 (i) le pCUC2::gai-1-VENUS (j). Diphanele (a, b) di bontsha mabota a matjha a sele (empa e seng a pele) a bopilweng ka hara SAM nakong ya dihora tse 10. Teko e phetilwe habedi ka diphetho tse tshwanang. h–j Papiso ya kabo ya maqhubu a tataiso ya sefofane sa karohano ya sele e fumanehang ho SAM yohle (h), IPR (i) le e seng ya IPR (j) pakeng tsa dimela tsa Col-0 le pCUC2::gai-1-VENUS. Boleng ba P bo fumanwe ho sebediswa teko ya Kolmogorov–Smirnov e nang le mehatla e mmedi.
Ka mor'a moo re ile ra leka phello ea ho thibela lets'oao la GA ka ho khetheha ho IPR. Ho fihlela sena, re sebelisitse promoter ea cotyledon cup 2 (CUC2) ho khanna tlhahiso ea protheine e mpe ea gai-1 e kopantsoeng le VENUS (moleng oa pCUC2::gai-1-VENUS). Ho SAM ea mofuta oa tlhaho, promoter ea CUC2 e khanna tlhahiso ea boholo ba li-IPR ho SAM, ho kenyeletsoa lisele tsa moeli, ho tloha ho P4 ho ea pele, 'me polelo e tšoanang e ikhethang e ile ea bonoa limela tsa pCUC2::gai-1-VENUS (sheba ka tlase). Kabo ea likhutlo tsa karohano ea sele ho pholletsa le SAM kapa IPR ea limela tsa pCUC2::gai-1-VENUS e ne e sa fapane haholo le ea mofuta oa tlhaho, leha ho sa lebelloa re ile ra fumana hore lisele tse se nang IPR limela tsena li arohane ka makhetlo a phahameng a 80–90° (Setšoantšo sa 6f–j).
Ho 'nile ha boleloa hore tataiso ea karohano ea sele e itšetlehile ka jeomethri ea SAM, haholo-holo khatello ea ho tensile e hlahisoang ke ho kobeha ha lisele46. Ka hona re ile ra botsa hore na sebopeho sa SAM se fetotsoe ho della global mutant le pCUC2::gai-1-VENUS limela. Joalokaha ho tlalehiloe pele12, boholo ba della global mutant SAM bo ne bo le boholo ho feta ba mofuta oa naha (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 13a, b, d). Ho kopanya CLV3 le STM RNA ka har'a situ ho tiisitse katoloso ea meristem ho li-mutants tsa della 'me ho feta moo ho bontšitse katoloso e ka thoko ea niche ea sele ea kutu (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 13e, f, h, i). Leha ho le joalo, kobeho ea SAM e ne e tšoana ho li-genotype ka bobeli (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 13k, m, n, p). Re bone keketseho e tšoanang ea boholo ho gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant ntle le phetoho ea kobeho ha e bapisoa le mofuta oa hlaha (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 13c, d, g, j, l, o, p). Maqhubu a tataiso ea karohano ea sele le ona a amehile ho della quadruple mutant, empa ka tekanyo e nyane ho feta ho della monolithic mutant (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 12d–f). Tšusumetso ena ea tekanyo, hammoho le ho hloka tšusumetso ho kobeho, e fana ka maikutlo a hore ts'ebetso ea RGL3 e setseng ho Della quadruple mutant e fokotsa liphetoho tataisong ea karohano ea sele e bakoang ke tahlehelo ea ts'ebetso ea DELLA le hore liphetoho likarohanong tsa lisele tse ka thoko li etsahala ka lebaka la liphetoho ts'ebetsong ea lipontšo tsa GA ho fapana le liphetoho ho jiometri ea SAM. Jwalo ka ha ho hlalositswe ka hodimo, mohlohlelletsi wa CUC2 o kganna tlhahiso ya IPR ho SAM ho qala ho P4 (Setshwantsho se Tlatsetsang sa 14a, b), mme ka lehlakoreng le leng, pCUC2::gai-1-VENUS SAM e ne e na le boholo bo fokotsehileng empa e le kobeho e phahameng (Setshwantsho se Tlatsetsang sa 14c–h). Phetoho ena sebopehong sa pCUC2::gai-1-VENUS SAM e ka fella ka kabo e fapaneng ya kgatello ya mechine ha e bapiswa le mofuta wa naha, moo kgatello e phahameng ya potoloho e qalang sebakeng se sekgutshwane ho tloha setsing sa SAM47. Ka tsela e nngwe, diphetoho sebopehong sa pCUC2::gai-1-VENUS SAM di ka bakwa ke diphetoho thepa ya mechini ya lebatowa e bakwang ke tlhahiso ya transgene48. Maemong ana ka bobedi, sena se ka fokotsa karolwana ditlamorao tsa diphetoho ho letshwao la GA ka ho eketsa monyetla wa hore disele di tla arohana ka tsela e potolohang/e potolohang, ho hlalosa seo re se boneng.
Ha re di kopanya, data ya rona e tiisa hore letshwao le phahameng la GA le bapala karolo e mafolofolo tataisong e ka thoko ya sefofane sa karohano ya sele ho IPR. Di boetse di bontsha hore ho kobeha ha meristem le hona ho susumetsa tataiso ya sefofane sa karohano ya sele ho IPR.
Tsela e tshekaletseng ya sefofane sa karohano ho IPR, ka lebaka la mosebetsi o phahameng wa ho bontsha GA, e fana ka maikutlo a hore GA e hlophisa faele ya sele ya radial ka hara epidermis ka hara SAM ho hlalosa mokgahlelo wa sele o tla fumanwa hamorao ho epidermal internode. Ka sebele, difaele tse jwalo tsa sele di ne di bonahala hangata ditshwantshong tsa SAM tsa diphetoho tsa della global (Setshwantsho sa 6b). Kahoo, ho hlahloba ka ho eketsehileng mosebetsi wa ntshetsopele ya paterone ya sebaka sa ho bontsha GA ho SAM, re sebedisitse setshwantsho sa time-lapse ho sekaseka mokgahlelo wa sebaka wa disele ho IPR ka dimela tsa mofuta wa tlhaho (Ler le Col-0), diphetoho tsa della global, le pCUC2::gai-1-VENUS transgenic.
Re fumane hore qmRGA e bontšitse hore ts'ebetso ea lipontšo tsa GA ho IPR e eketsehile ho tloha ho P1/P2 mme ea fihla sehlohlolong ho P4, 'me mokhoa ona o ile oa lula o tsitsitse ha nako e ntse e ea (Setšoantšo sa 4a–f le Setšoantšo se Tlatsetsang sa 8c–f, k). Ho sekaseka tlhophiso ea sebaka sa lisele ho IPR ka lets'oao le ntseng le eketseha la GA, re ngotse lisele tsa Ler IPR ka holimo le mahlakoreng a P4 ho latela qetello ea tsona ea nts'etsopele e hlahlobiloeng lihora tse 34 kamora ho shebella ka lekhetlo la pele, ke hore, makhetlo a fetang a mabeli a plastid, e leng se re lumellang ho latela lisele tsa IPR nakong ea nts'etsopele ea primordium ho tloha P1/P2 ho ea ho P4. Re sebelisitse mebala e meraro e fapaneng: mosehla bakeng sa lisele tseo tse neng li kopantsoe le primordium haufi le P4, botala bakeng sa tse neng li le ho IPR, le pherese bakeng sa ba nkileng karolo lits'ebetsong ka bobeli (Setšoantšo sa 7a–c). Ho t0 (0 h), mekhahlelo e 1–2 ea lisele tsa IPR e ne e bonahala ka pel'a P4 (Setšoantšo sa 7a). Jwalo ka ha ho ne ho lebelletswe, ha disele tsena di arohana, di entse jwalo haholoholo ka sefofane sa karohano se rapaletseng (Ditshwantsho tsa 7a–c). Diphetho tse tshwanang di fumanwe ho sebediswa Col-0 SAM (ho shebanwe le P3, eo moedi wa yona o menang ka ho tshwana le P4 ho Ler), le hoja mofuta ona wa genotype lesoba le entsweng moeding wa dipalesa le ile la pata disele tsa IPR ka potlako (Setshwantsho sa 7g–i). Kahoo, paterone ya karohano ya disele tsa IPR e hlophisa disele pele ka mela ya radial, jwalo ka di-internode. Tlhophiso ya mela ya radial le sebaka sa disele tsa IPR pakeng tsa ditho tse latellanang di fana ka maikutlo a hore disele tsena ke di-internodal progenitors.
Mona, re qapile biosensor ea GA signaling ea ratiometric, qmRGA, e lumellang ho etsa 'mapa oa bongata oa ts'ebetso ea GA signaling e hlahisoang ke mahloriso a kopaneng a GA le GA receptor ha re ntse re fokotsa tšitiso le litsela tsa GA signaling tsa tlhaho, ka hona re fana ka tlhahisoleseling mabapi le ts'ebetso ea GA boemong ba sele. Ho fihlela sena, re hahile protheine e fetotsoeng ea DELLA, mRGA, e lahlehetsoeng ke bokhoni ba ho tlama balekane ba tšebelisano ea DELLA empa e ntse e le hlokolosi ho proteolysis e bakoang ke GA. qmRGA e arabela liphetohong tsa kantle le tsa tlhaho maemong a GA, 'me thepa ea eona ea ho lemoha e matla e nolofalletsa tlhahlobo ea liphetoho tsa sebaka mosebetsing oa GA signaling nakong ea nts'etsopele. qmRGA hape ke sesebelisoa se tenyetsehang haholo kaha se ka fetoloa ho ea ka lisele tse fapaneng ka ho fetola promoter e sebelisitsoeng bakeng sa tlhahiso ea eona (haeba ho hlokahala), 'me ka lebaka la tlhaho e bolokiloeng ea tsela ea GA signaling le motif ea PFYRE ho pholletsa le li-angiosperms, ho ka etsahala hore e ka fetisetsoa ho mefuta e meng22. Tumellanong le sena, phetoho e lekanang le protheine ea raese ea SLR1 DELLA (HYY497AAA) le eona e bontšitsoe e thibela ts'ebetso ea khatello ea kholo ea SLR1 ha e ntse e fokotsa ho senyeha ha eona ho bakoang ke GA hanyane feela, ho tšoana le mRGA23. Haholo-holo, lithuto tsa morao tjena ho Arabidopsis li bontšitse hore phetoho e le 'ngoe ea amino acid sebakeng sa PFYRE (S474L) e fetotse ts'ebetso ea transcriptional ea RGA ntle le ho ama bokhoni ba eona ba ho sebelisana le balekane ba transcription factor50. Le hoja phetoho ena e le haufi haholo le li-substitution tse 3 tsa amino acid tse teng ho mRGA, lithuto tsa rona li bontša hore liphetoho tsena tse peli li fetola litšobotsi tse ikhethang tsa DELLA. Le hoja balekane ba bangata ba transcription factor ba tlamahane le libaka tsa LHR1 le SAW tsa DELLA26,51, li-amino acid tse ling tse bolokiloeng sebakeng sa PFYRE li ka thusa ho tsitsisa likamano tsena.
Nts'etsopele ea li-internode ke tšobotsi ea bohlokoa meahong ea limela le ntlafatsong ea chai. qmRGA e senotse ts'ebetso e phahameng ea lipontšo tsa GA liseleng tsa IPR internode progenitor. Ka ho kopanya litšoantšo tsa bongata le liphatsa tsa lefutso, re bontšitse hore mekhoa ea lipontšo tsa GA e phahamisa lifofane tsa karohano ea sele tse chitja/tse fetang ka har'a epidermis ea SAM, e bopa mokhatlo oa karohano ea sele o hlokahalang bakeng sa nts'etsopele ea li-internode. Balaoli ba 'maloa ba tataiso ea sefofane sa karohano ea sele ba fumanoe nakong ea nts'etsopele52,53. Mosebetsi oa rona o fana ka mohlala o hlakileng oa kamoo ts'ebetso ea lipontšo tsa GA e laolang paramethara ena ea sele. DELLA e ka sebelisana le li-complexes tsa protheine tse qalang41, kahoo pontšo ea GA e ka laola tataiso ea sefofane sa karohano ea sele ka ho susumetsa ka ho toba tataiso ea cortical microtubule40,41,54,55. Re bontšitse ka tšohanyetso hore ho SAM, kamano ea ts'ebetso e phahameng ea lipontšo tsa GA e ne e se ho lelefatsa ha sele kapa karohano, empa e ne e le anisotropy ea kholo feela, e tsamaellanang le phello e tobileng ea GA tataisong ea karohano ea sele ho IPR. Leha ho le joalo, re ke ke ra qhelela ka thoko hore phello ena e ka boela ea ba e sa tobang, mohlala, e tsamaisoang ke ho nolofatsa lebota la sele le bakoang ke GA56. Liphetoho tse teng thepeng ea lebota la sele li baka khatello ea mechine57,58, e leng se ka boela sa susumetsa tsela eo sefofane sa karohano ea sele se tsamaeang ka eona ka ho ama tsela eo li-microtubules tsa cortical39,46,59 li tsamaeang ka eona. Litlamorao tse kopaneng tsa khatello ea mechine e bakoang ke GA le taolo e tobileng ea tsela eo li-microtubule li tsamaeang ka eona ke GA li ka ameha ho hlahiseng mokhoa o itseng oa tsela eo li-internode li tsamaeang ka eona ho IPR ho hlalosa li-internode, 'me ho hlokahala lithuto tse ling ho leka mohopolo ona. Ka mokhoa o ts'oanang, lithuto tse fetileng li totobalitse bohlokoa ba liprotheine tse sebelisanang le DELLA TCP14 le 15 taolong ea ho thehoa ha li-internode60,61 'me lintlha tsena li ka buella ketso ea GA hammoho le BREVIPEDICELUS (BP) le PENNYWISE (PNY), tse laolang nts'etsopele ea li-internode 'me li bontšitsoe li susumetsa GA signaling2,62. Kaha DELLA e sebelisana le brassinosteroid, ethylene, jasmonic acid, le abscisic acid (ABA) signaling pathways63,64 le hore lihormone tsena li ka susumetsa microtubule orientation65, liphello tsa GA ho orientation ea karohano ea sele le tsona li ka tsamaisoa ke lihormone tse ling.
Lithuto tsa pele tsa cytological li bontšitse hore libaka tse ka hare le tse ka ntle tsa Arabidopsis SAM lia hlokahala bakeng sa nts'etsopele ea li-internode2,42. 'Nete ea hore GA e laola ka mafolofolo karohano ea sele liseleng tse ka hare12 e tšehetsa mosebetsi o habeli oa GA ho laoleng meristem le boholo ba li-internode ho SAM. Mokhoa oa karohano ea sele e tataisoang le oona o laoloa ka thata liseleng tse ka hare tsa SAM, 'me molao ona oa bohlokoa bakeng sa kholo ea kutu52. Ho tla ba monate ho hlahloba hore na GA le eona e bapala karolo ho lebiseng sefofane sa karohano ea sele mokhatlong o ka hare oa SAM, ka hona ho hokahanya litlhaloso le nts'etsopele ea li-internode ka hare ho SAM.
Limela li ile tsa lengoa ka hare ho mobu kapa 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) e tlatselitsoeng ka 1% sucrose le 1% agar (Sigma) tlas'a maemo a tloaelehileng (khanya ea lihora tse 16, 22 °C), ntle le liteko tsa hypocotyl le kholo ea metso moo lipeo li ileng tsa lengoa lipoleiting tse otlolohileng tlas'a khanya e sa fetoheng le 22 °C. Bakeng sa liteko tsa nitrate, limela li ile tsa lengoa holim'a modified MS medium (bioWORLD plant medium) e tlatselitsoeng ka nitrate e lekaneng (0 kapa 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% sucrose le 1% A-agar (Sigma) tlas'a maemo a letsatsi le lelelele.
GID1a cDNA e kentsweng ho pDONR221 e kopantswe hape le pDONR P4-P1R-pUBQ10 le pDONR P2R-P3-mCherry ho pB7m34GW ho hlahisa pBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNA e kentsweng ho pDONR221 e kopantswe hape ho pB7RWG266 ho hlahisa p35S:IDD2-RFP. Ho hlahisa pGID1b::2xmTQ2-GID1b, karoloana ea 3.9 kb e holimo ho sebaka sa ho ngola khoutu sa GID1b le karoloana ea 4.7 kb e nang le GID1b cDNA (1.3 kb) le terminator (3.4 kb) li ile tsa atolosoa pele ho sebelisoa li-primer tse ho Tlatsetso Tafoleng ea 3 ebe li kenngoa ho pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) le pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), ka ho latellana, 'me qetellong tsa kopanngoa hape le pDONR221 2xmTQ268 ho vector ea pGreen 012567 ho sebelisoa cloning ea Gateway. Ho hlahisa pCUC2::LSSmOrange, tatellano ea promoter ea CUC2 (3229 bp holimo ho ATG) e lateloang ke tatellano ea ho ngola khoutu ea mOrange e kholo ea Stokes-shifted (LSSmOrange)69 ka lets'oao la sebaka sa nyutlelie la N7 le terminator ea transcriptional ea NOS li ile tsa kopanngoa ka har'a vector ea pGreen kanamycin e shebaneng le ho sebelisoa sistimi ea Gateway 3-fragment recombination (Invitrogen). Vector ea binary ea semela e ile ea kenngoa ka har'a mofuta oa Agrobacterium tumefaciens GV3101 'me ea kenngoa makhasing a Nicotiana benthamiana ka mokhoa oa Agrobacterium infiltration le ka har'a Arabidopsis thaliana Col-0 ka mokhoa oa ho qoelisa lipalesa, ka ho latellana. pBQ10::qmRGA pBQ10::GID1a-mCherry le pCLV3::mCherry-NLS qmRGA li ile tsa aroloa ho tsoa ho bana ba F3 le F1 ba lifapano tse fapaneng, ka ho latellana.
Ho kopanya RNA in situ ho entswe hodima dintlha tse ka bang bolelele ba 1 cm72, tse ileng tsa bokellwa mme tsa lokiswa hang-hang ka hara tharollo ya FAA (3.7% formaldehyde, 5% acetic acid, 50% ethanol) e phodisitsweng pele ho 4 °C. Kamora kalafo ya vacuum ya metsotso e 2 × 15, fixative e ile ya fetolwa mme disampole tsa futhumatswa bosiu bohle. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, le RGL3 cDNAs le di-probe tsa antisense ho di-3′-UTR tsa tsona di ile tsa kopanngwa ho sebediswa di-primer tse bontshitsweng ho Tlatsetso ya Tafole ya 3 jwalo ka ha ho hlalositswe ke Rosier et al.73. Li-probe tse nang le leibole ea Digoxigenin li ile tsa fumanoa li sebelisa li-antibodies tsa digoxigenin (tlhakiso ea makhetlo a 3000; Roche, nomoro ea khataloge: 11 093 274 910), 'me likarolo li ne li daelitsoe ka tharollo ea 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, tlhakiso ea makhetlo a 250)/nitroblue tetrazolium (NBT, tlhakiso ea makhetlo a 200).
Nako ea poso: Hlakola-10-2025