Setlhare sa anthelmintic N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) ho tlalehiloe hore ho thibela AChE (acetylcholinesterase) 'me ho na le litšobotsi tse ka bakang kankere ka lebaka la ho kenngoa ha methapo ea mali ka bongata. Pampiring ena, re bontša hore DEET e hlasimolla ka ho khetheha lisele tsa endothelial tse khothalletsang angiogenesis, ka hona e eketsa kholo ea hlahala. DEET e kenya tšebetsong lits'ebetso tsa sele tse lebisang ho angiogenesis, ho kenyeletsoa ho ata, ho falla le ho khomarela. Sena se amahanngoa le keketseho ea tlhahiso ea NO le tlhahiso ea VEGF liseleng tsa endothelial. Ho khutsisa M3 kapa ho sebelisa li-inhibitor tsa M3 tsa meriana ho felisitse liphello tsena tsohle, ho fana ka maikutlo a hore angiogenesis e bakoang ke DEET e na le kutloelo-bohloko ho M3. Liteko tse kenyeletsang calcium signaling liseleng tsa endothelial le HEK tse hlahisang li-receptor tsa M3 ka bongata, hammoho le lithuto tsa ho tlama le ho emisa, li bontša hore DEET e sebetsa e le modulator ea allosteric ea li-receptor tsa M3. Ho feta moo, DEET e thibela AChE, ka hona e eketsa ho fumaneha ha acetylcholine le ho tlama ha eona ho li-receptor tsa M3, le ho ntlafatsa litlamorao tsa proangiogenic ka taolo ea allosteric.
Li-EC tsa mantlha li ile tsa aroloa ho tloha aorta ea litoeba tsa Switzerland. Mokhoa oa ho ntša o ile oa fetoloa ho latela protocol ea Kobayashi 26. Li-EC tsa murine li ile tsa lengoa ka mokhoa oa EBM-2 o tlatselitsoeng ka 5% ea FBS e sa sebetseng mocheso ho fihlela karolo ea bone e feta.
Tšusumetso ea mahloriso a mabeli a DEET ho ata ha HUVEC, U87MG, kapa BF16F10 e ile ea hlahlojoa ho sebelisoa CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Ka bokhutšoanyane, lisele tse 5.103 selibeng ka seng li ile tsa jaloa ka poleiting ea liliba tse 96, tsa lumelloa ho hokela bosiu bohle, ebe li phekoloa ka DEET lihora tse 24. Kamora ho tlosa sebaka sa kholo, eketsa tharollo ea ho tlama dae selibeng ka seng sa microplate 'me u futhumatse lisele ho 37 °C metsotso e 30. Maemo a khanya a ile a fumanoa ho sebelisoa sesebelisoa sa ho bala microplate sa Mithras LB940 multimode (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Jeremane) se nang le li-filter tsa ho hlasimolla tsa 485 nm le li-filter tsa ho ntša metsi tsa 530 nm.
HUVEC e ile ea jaloa ka lipoleiting tse 96 tsa liliba ka bongata ba lisele tse 104 ka seliba. Lisele li ile tsa phekoloa ka DEET lihora tse 24. Ho phela ha sele ho ile ha hlahlojoa ho sebelisoa teko ea colorimetric MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Boleng ba letsoalo la optical bo fumanoe ho multimode microplate reader (Mithras LB940) ka bolelele ba leqhubu la 570 nm.
Litlamorao tsa DEET li ithutiloe ho sebelisoa liteko tsa angiogenesis ka hare ho vitro. Kalafo ka 10-8 M kapa 10-5 M DEET e ekelitse ho thehoa ha bolelele ba capillary ho HUVECs (Setšoantšo sa 1a, b, li-white bars). Ha ho bapisoa le sehlopha sa taolo, kalafo ka mahloriso a DEET a tlohang ho 10-14 ho isa ho 10-5 M e bontšitse hore bolelele ba capillary bo fihlile sehlabeng ho 10-8 M DEET (Setšoantšo se Tlatsetsang S2). Ha ho phapang e kholo e fumanoeng phellong ea proangiogenic ea HUVECs e phekoloang ka DEET ka hare ho mahloriso a 10-8 M le 10-5 M.
Ho fumana phello ea DEET ho neovascularization, re entse lithuto tsa neovascularization in vivo. Kamora matsatsi a 14, litoeba tse entetsoeng ka lisele tsa endothelial tse lenngoeng pele ka 10-8 M kapa 10-5 M DEET li bontšitse keketseho e kholo ea hemoglobin (Setšoantšo sa 1c, li-white bar).
Ho feta moo, neovascularization e bakwang ke DEET e ile ya ithutwa ho dipeba tse nang le xenograft tsa U87MG tse neng di entwa letsatsi le letsatsi (ip) le DEET ka tekanyo e tsejwang ho baka mahloriso a plasma a 10-5 M, e leng ntho e tlwaelehileng ho batho ba pepesehileng. ho 23. Dihlahala tse bonahalang (ke hore dihlahala tse >100 mm3) di ile tsa bonwa matsatsi a 14 kamora ho entwa ha disele tsa U87MG ho dipeba. Letsatsing la 28, kgolo ya hlahala e ile ya eketseha haholo ho dipeba tse phekotsweng ke DEET ha di bapiswa le dipeba tse laolang (Setshwantsho sa 1d, dikwere). Ho feta moo, ho daya ha dihlahala ka CD31 ho bontshitse hore DEET e ekeditse sebaka sa capillary haholo empa e seng bongata ba dikokwana-hloko. (Setshwantsho sa 1e–g).
Ho fumana karolo ea li-receptor tsa muscarinic keketsehong e bakoang ke DETA, ho sebelisitsoe 10-8 M kapa 10-5 M DETA boteng ba pFHHSiD (10-7 M, mohanyetsi oa li-receptor oa M3 ea khethiloeng). Kalafo ea HUVEC. pFHHSiD e thibetse ka botlalo thepa ea ho ata ha DETA maemong 'ohle a tebileng (Tafole ea 1).
Tlas'a maemo ana, re boetse ra hlahloba hore na DEET e tla eketsa bolelele ba capillary liseleng tsa HUVEC. Ka mokhoa o ts'oanang, pFHHSiD e thibetse bolelele ba capillary bo bakoang ke DEET haholo (Setšoantšo sa 1a, b, li-gray bars). Ho feta moo, liteko tse tšoanang li entsoe ka M3 siRNA. Leha siRNA ea taolo e ne e sa sebetse hantle ho ntšetseng pele ho thehoa ha capillary, ho khutsisa receptor ea M3 muscarinic ho felisitse bokhoni ba DEET ba ho eketsa bolelele ba capillary (Setšoantšo sa 1a, b, li-black bars).
Ho feta moo, ho ruruha ha methapo ya madi ho bakwang ke 10-8 M kapa 10-5 M ka hara vitro le ho ruruha ha methapo ya madi ka hara vivo ho ile ha thibelwa ka botlalo ke pFHHSiD (Setshwantsho sa 1c, d, di-circles). Diphetho tsena di bontsha hore DEET e kgothaletsa angiogenesis ka tsela e amehang ho di-antagonist tse kgethilweng tsa M3 receptor kapa M3 siRNA.
AChE ke sepheo sa limolek'hule sa DEET. Lithethefatsi tse kang donepezil, tse sebetsang e le li-inhibitor tsa AChE, li ka hlohlelletsa EC angiogenesis ka har'a vitro le ka har'a mehlala ea ischemia ea maoto a morao ea mouse14. Re lekile phello ea mahloriso a mabeli a DEET mosebetsing oa enzyme ea AChE ho HUVEC. Mahloriso a tlase (10-8 M) le a holimo (10-5 M) a DEET a fokolitse mosebetsi oa AChE oa endothelial ha a bapisoa le maemo a taolo (Setšoantšo sa 2).
Maqhutsu ka bobeli a DEET (10-8 M le 10-5 M) a fokolitse ts'ebetso ea acetylcholinesterase ho HUVEC. BW284c51 (10-5 M) e sebelisitsoe e le taolo bakeng sa li-inhibitor tsa acetylcholinesterase. Liphetho li hlahisoa e le peresente ea ts'ebetso ea AChE ho HUVEC e phekoloang ka maqhutsu a mabeli a DEET ha a bapisoa le lisele tse phekoloang ka koloi. Boleng bo hlahisoa e le karolelano ea ± SEM ea liteko tse tšeletseng tse ikemetseng. *p < 0.05 ha e bapisoa le taolo (teko ea papiso e ngata ea Kruskal-Wallis le Dunn).
Nitric oxide (NO) e ameha ts'ebetsong ea angiogenic 33, ka hona, tlhahiso ea NO ho li-HUVEC tse susumelitsoeng ke DEET e ile ea ithutoa. Tlhahiso ea endothelial NO e phekoloang ke DEET e ile ea eketseha ha e bapisoa le lisele tsa taolo, empa ea fihla bohlokoa feela ka tekanyo ea 10-8 M (Setšoantšo sa 3c). Ho fumana liphetoho tsa limolek'hule tse laolang tlhahiso ea NO e bakoang ke DEET, tlhahiso ea eNOS le ts'ebetso li ile tsa hlahlojoa ke Western blotting. Leha kalafo ea DEET e sa ka ea fetola tlhahiso ea eNOS, e ekelitse phosphorylation ea eNOS haholo sebakeng sa eona se sebetsang (Ser-1177) ha e ntse e fokotsa sebaka sa eona se thibelang (Thr-495) ha e bapisoa le lisele tse sa phekoloang ho phosphorylation ea eNOS (Setšoantšo sa 3d). Ho feta moo, karolelano ea eNOS e nang le phosphorylated sebakeng sa ts'ebetso le sebaka se thibelang e ile ea baloa ka mor'a ho etsa hore palo ea eNOS e nang le phosphorylated e be boemong bo tloaelehileng ho palo eohle ea enzyme. Karolelano ena e ile ea eketseha haholo ho li-HUVEC tse phekoloang ka khatello e 'ngoe le e 'ngoe ea DEET ha e bapisoa le lisele tse sa phekoloang (Setšoantšo sa 3d).
Qetellong, tlhahiso ea VEGF, e 'ngoe ea lintlha tse ka sehloohong tsa proangiogenic, e ile ea hlahlojoa ke Western blotting. DEET e ekelitse tlhahiso ea VEGF haholo, athe pFHHSiD e thibetse polelo ena ka botlalo.
Kaha ditlamorao tsa DEET di a utlwahala ho thibelo ya meriana le ho fokotseha ha di-receptor tsa M3, re lekile kgopolo-taba ya hore DEET e ka ntlafatsa letshwao la calcium. Ka mokhoa o makatsang, DEET e hlolehile ho eketsa calcium ya cytoplasm ho HUVEC (data ha e bontshwa) le HEK/M3 (Setshwantsho sa 4a, b) bakeng sa mahloriso ka bobedi a sebediswang.
Nako ea poso: Tshitwe-30-2024