Libolaya-dikokwanyana li bapala karolo ea bohlokoa ho sebetsaneng le khaello ea lijo lefatšeng ka bophara le ho loants'a mafu a batho a bakoang ke likokoana-hloko. Leha ho le joalo, bothata bo ntseng bo hola ba ho hanyetsa chefo e bolaeang likokoanyana bo hloka ka potlako ho sibolloa ha metsoako e mecha e shebaneng le lipheo tse sa sebelisoeng hantle. Likanale tsa TRPV—Nanzhong (Nan) le tse sa sebetseng (Iav)—li ka theha likanale tse fapaneng (Nan-Iav) 'me tsa kena ho litho tsa mechanosensory tse laolang geotropism, kutlo le proprioception likokoanyanang. Libolaya-dikokwanyana tse ling, tse kang aphidopyrrolidone (AP), li shebana le Nan-Iav ka mekhoa e sa tsejoeng. AP e sebetsa hantle khahlanong le likokoanyana tse hlabang-tse monyang (hemipterans), e thibela ho fepa ka ho sitisa mosebetsi oa likhoele. AP e ka tlama Nan feela, empa ke Nan-Iav feela e ka sebelisanang le li-agonists, ho kenyeletsoa le nicotinamide ea tlhaho (NAM), ka hona e bontša ts'ebetso ea kanale. Ho sa tsotellehe bokhoni ba Nan-Iav e le sepheo sa chefo e bolaeang likokoanyana, ho tsejoa hanyane ka kopano ea eona ea kanale, libaka tsa taolo tsa ho tlama, le taolo e itšetlehileng ka Ca2+, e sitisang nts'etsopele e eketsehileng ea chefo e bolaeang likokoanyana. Phuputsong ena, microscopy ea cryo-electron e sebelisitsoe ho fumana sebopeho sa Nan-Iav likokoanyanang tsa Hemiptera tse se nang calmodulin-ligand, hammoho le AP le NAM moeling oa sebaka sa ankyrin repeat cytoplasmic (ARD). Ho makatsang ke hore re fumane hore protheine ea Nan ka boeona e ka etsa pentamer, e tsitsitseng ka likamano tsa ARD tse tsamaisoang ke AP. Phuputso ena e senola likamano tsa limolek'hule pakeng tsa likokoanyana tse bolaeang likokoanyana le li-agonist le Nan-Iav, e totobatsang bohlokoa ba ARD mosebetsing le kopanong ea kanale, le ho hlahloba mokhoa oa taolo ea Ca2+.
Khahlanong le boemo ba phetoho e mpe ea tlelaemete lefatšeng ka bophara, ho putlama ha ts'ireletso ea lijo lefatšeng ka bophara ke e 'ngoe ea liphephetso tse kholo tsa lekholo la bo21 la lilemo, ka litlamorao tse mpe sechabeng.1,2Tlaleho ea Mokhatlo oa Lefatše oa Bophelo bo Botle ea Boemo ba Tšireletso ea Lijo le Phepo Lefatšeng ka 2023 (SOFI) e hakanya hore batho ba ka bang limilione tse likete tse 2.33 lefatšeng ka bophara ba na le bothata ba ho se sireletsehe ha lijo ka tekanyo e itekanetseng ho isa ho e matla, e leng bothata bo bileng teng nako e telele.3,4Ka bomalimabe, ho hakanngoa hore 20% ho isa ho 30% kapa ho feta ea chai ea lijalo e lahleha selemo le selemo ka lebaka la likokoanyana le likokoana-hloko, 'me ho futhumala ha lefatše ho lebelletsoe ho mpefatsa ho hanyetsa likokoanyana le ho ba kotsing ea lijalo.4,5,6,7,8Ntlafatso ea chefo e bolaeang likokoanyana e bohlokoa eseng feela ho sireletsa lijalo ho likokoanyana tse senyang lijalo le ho fokotsa ho ata ha likokoana-hloko tse jang likokoana-hloko, empa hape le ho loantša mafu a batho a jang likokoanyana a kang feberu ea dengue, malaria le lefu la Chagas, tse ntseng li hanyetsa chefo e bolaeang likokoanyana ka ho eketsehileng.5,9,10,11
Har'a lipheo tse kholo tsa meriana e bolaeang likokoanyana e nang le chefo methapong, heterotetrameric TRPV channel Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) e emela sehlopha sa lipheo tsa meriana e bolaeang likokoanyana tse fumanoeng lilemong tse leshome tse fetileng feela, ho kenyeletsoa le meriana e bolaeang likokoanyana e fumanehang khoebong joalo ka imidacloprid le pyraclostrobin.12,13,14Sebolaya-dikokwana-hloko sa aphidopyrrolifen (AP) se entsoeng ka semisynthetic ke sehlahisoa se sa tsoa ntshetswa pele le ho rekiswa seo karolo ya sona e ka sehloohong e leng sebolaya-dikokwana-hloko se sebetsang sa Inscalis®, se tlamang AP boemong ba ts'ebetso ya subnanomolar.15AP e na le chefo e tlase haholo ho di-peo tse tsamaisang peo, dikokonyana tse molemo, le diphedi tse ding tse sa rerelwang, mme ha e sebediswa ho ya ka ditaelo tse ngotsweng leibole, e ka fokotsa kgatello ya ho hanyetsa dibolaya-dikokwanyana tse ding.16,17,18Nan le Iav li hasane haholo ho pholletsa le mefuta ea likokoanyana, li hlahisoa hammoho feela ka har'a li-neuron tsa li-receptor tsa chordal stretch tsa li-antennae le maoto, 'me li bohlokoa bakeng sa ho utloa, kutloisiso ea matla a khoheli le ho lemoha beng ba tsona.13,16,19,20,21,22AP, imidacloprid, le pyraclostrobin li hlasimolla motsoako oa Nan-Iav ka mokhoa o ikhethang, qetellong li thibela phetisetso ea lets'oao la proprioceptive.13,16,23Ho likokoanyana tse monyang tse hlabang (hemipterans) tse kang hoaba le lintsintsi tse tšoeu, tahlehelo ea ho lemoha lintho tse itseng e sitisa bokhoni ba tsona ba ho ja, e leng se qetellang se lebisitse lefung.13,24Hoa thahasellisa hore AP e bonts'a kamano e phahameng bakeng sa motsoako oa Nan-Iav le kamano e tlase bakeng sa Nan feela. Ho tlamahana ha AP le Nan-Iav ho baka motlakase, empa ho tlamahana le Nan feela ha ho hlohlelletse ts'ebetso ea kanale. Iav ka boeona ha e tlame ho AP ho hang.16Sena se fana ka maikutlo a hore Nan le Iav li ka kopana ho theha metsoako e fapaneng ea likanale tsa Nan-Iav (mohlala, ka likarohano tse fapaneng tsa stoichiometric kapa litokisetso tse fapaneng ka har'a karolelano e tšoanang ea stoichiometric) kapa hore AP e ka kopana libakeng tse ngata. Ho feta moo, nicotinamide ea tlhaho ea agonist (NAM) e kopana le Drosophila Nan-Iav ka micromolar affinity, e bonts'a litlamorao tse tšoanang le tsa aphids (AP) ka har'a vitro.16,25le ho thibela ho ikatisa le ho fepa li-aphid, e leng se qetellang se lebisa lefung la tsona.25,26. Lintlha tsena li hlahisa lipotso tse ngata. Mohlala, ho ntse ho sa hlaka hore na heterodimer ea Nan-Iav e thehoa joang, hore na ke libaka life tse tlamang tse sebelisoang ho fetola limolek'hule tse nyane, le hore na limolek'hule tsena tse nyane li laola ts'ebetso ea kanale joang ka ho thibela proprioception. Ho feta moo, mabaka a hore na ke hobane'ng ha Nan ka boeona e sa sebetse 'me e na le kamano e tlase bakeng sa AP, ha heterodimer ea Nan-Iav e sebetsa 'me e tlama AP ka kamano e phahameng, e ntse e sa hlaka. Qetellong, ho tsejoa hanyane ka taolo e itšetlehileng ka Ca2+ ea ts'ebetso ea Nan-Iav le hore na e kopantsoe joang lits'ebetsong tsa lipontšo tsa neuronal.. 13,21
Thutong ena, e kopantseng microscopy ea cryo-electron, electrophysiology, le mekhoa ea ho tlama radioligand, re hlakisitse kopano ea Nan-Iav le mokhoa oa ho tlama ha eona ho balaoli ba limolek'hule tse nyane. Ho feta moo, re fumane calmodulin (CaM) e tlamiloeng ka mokhoa o ikemetseng ho Iav le li-pentamer tsa Nan tse tsitsitseng tsa AP. Liphetho tsena li fana ka temohisiso ea bohlokoa mabapi le taolo ea li-ion tsa calcium likanaleng, kopano ea kanale, le lintlha tse khethollang kamano ea ligand. Habohlokoa le ho feta, re tiisitse hore ARD e bapala karolo ea bohlokoa lits'ebetsong tsena. Thuto ea rona ea likanale tse felletseng tsa likokoanyana tse tlamiloeng ho chefo e bolaeang likokoanyana ea temo e amehang.27, 28, 29e bula menyetla ea nts'etsopele ea indasteri ea chefo e bolaeang likokoanyana, e ntlafatsa katleho le ho hlaka ha chefo e bolaeang likokoanyana, le ho nolofalletsa ts'ebeliso ea metsoako e shebaneng le TRPV ho mefuta e meng ho sebetsana le ts'ireletso ea lijo lefatšeng ka bophara le ho ata ha mafu a bakoang ke likokoanyana.
Hape re fumane hore Nan-Iav e laoloa ke Ca2+, 'me mokhoa oa taolo o tsamaisoa ke CaM e tlamiloeng ka mokhoa o ikemetseng. Habohlokoa, taolo ena e itšetlehileng ka Ca2+ ea Nav ke CaM e fapana haholo le mekhoa ea taolo ea liteishene tse ling tsa ion (mohlala, liteishene tsa Na+ tse kenngoeng ke motlakase le liteishene tsa TRPV5/6)52,53,54,55,56,57Mokero wa Nav1.2, sebaka sa C-terminal sa CaM se amahanya ka ho feletseng le sebaka sa C-terminal (CTD), mme Ca2+ e baka ho tlamahana ha sebaka sa yona sa N-terminal karolong e ka thoko ya CTD.56Ka har'a kanale ea TRPV5/6, sebaka sa C-terminal sa CaM se tlama ho CTH, 'me Ca2+ e baka katoloso e phahameng ea sebaka sa eona sa N-terminal ka har'a pore, ka hona e thibela ho kenella ha cation.53,54. Re sisinya mohlala bakeng sa mosebetsi o laoloang ke Ca2+ oa Nan-Iav-CaM (Setšoantšo sa 4h). Mohlaleng ona, sebaka sa N-terminal sa CaM se tlama ka kotloloho sebakeng sa C-terminal (CTH) sa Iav. Boemong ba ho phomola (khatello e tlase ea [Ca2+], sebaka sa C-terminal sa CaM se sebelisana le Nan, se tsitsisa sebopeho sa ARD mme ka hona se khothalletsa ho buloa ha kanale. Ho tlama agonist/likokoanyana ho kanale ho baka ho buloa ha pore, ho lebisang ho phallo ea Ca2+. Ca2+ ebe e tlama ho CaM, e bakang ho arohana ha sebaka sa C-terminal ho tsoa ho ARD ea Nan. Hobane ho thibela ho tlama ha CaM ho felisa phello ea thibelo ea Ca2+, ho arohana hona ho fetola motsamao oa ARD, ka hona ho baka thibelo kapa ho se utloisisehe ho itšetlehileng ka Ca2+. Ho hlaphoheloa ka potlako ha maqhubu a kanale kamora ho hlakoloa ha calcium ion (Setšoantšo sa 4g) ho fana ka maikutlo a hore mokhoa ona o nolofalletsa likarabo tse potlakileng ho matšoao a neuronal a tsamaisoang ke Ca2+. Ho feta moo, sebaka sa C-terminal sa Iav, se ntseng se sa utloisisoe hantle, se tlalehiloe se bapala karolo e 'ngoe ho shebaneng le kanale le molaong oa hajoale.21
Qetellong, thuto ea rona e hlahisa sebopeho se phahameng sa mothapo oa TRP oa chefo ea likokoanyana le likokoanyana oa bohlokoa temong—e leng tšibollo eo re neng re sa e tsebe pele. Habohlokoa ke hore re hlalositse sebopeho le mosebetsi oa mothapo oa likokoanyana liseleng tsa batho (HEK293S GnTi–) ho fapana le liseleng tsa likokoanyana. Ha re tobane le khanyetso e ntseng e hola ea chefo ea likokoanyana le khatello e tsoelang pele ea polokeho ea lijo le likokoana-hloko, mosebetsi oa rona o fana ka tlhahisoleseling ea bohlokoa e tla nolofatsa nts'etsopele ea chefo e ncha bakeng sa melemo ea bophelo bo botle ba batho le polokeho ea lijo lefatšeng ka bophara. Lithuto li bontšitse hore chefo e bolaeang likokoanyana e kang AP e sebetsa khahlanong le likokoanyana tse ling ha e sebelisoa ho latela litaelo tsa leibole 'me e na le chefo e tlase e matla ho li-peoline tse molemo, e leng se bontšang polokeho ea tsona tikolohong.13,16Ho feta moo, liteko tsa di-derivative tse ding tsa AP ho menoang di bontshitse hore qetellong di lahlehelwa ke bokgoni ba tsona ba ho fofa. Ho utlwisisa hore na di-compound tsena tse fetolang di kopana jwang le Nan-Iav ho tla nolofatsa phetoho ya di-compound tse teng kapa ntshetsopele ya di-compound tse ntjha bakeng sa katleho le katleho e eketsehileng.e nepahetsengtaolo ea likokoanyana. Phuputso ea rona e bontša hore sebopeho sa Nan-Iav ARD ha se bohlokoa feela bakeng sa ho laola ts'ebetso ea metsoako ea tlhaho, chefo e bolaeang likokoanyana le Ca2+-CaM, empa hape le bakeng sa kopano ea kanale. Re fana ka maikutlo a hore ho sitisa kopano ea heterodimer ka limolek'hule tse nyane e ka ba mokhoa o ikhethang le o tšepisang oa ho nts'etsapele lithibela-mafu tsa kanale ea ion.
Ho dijini tse robedi tse nang le orthologous, dijini tse bolelele bo felletseng tsa kokoanyana e sootho (Halyomorpha halys) Nanchung le Inactive di kgethilwe, di bontsha botsitso bo botle ka hara sesepa. Dijini tse entsweng di ile tsa ntlafatswa ka codon bakeng sa tlhahiso ya motho mme tsa kopanngwa ka har'a vector ya pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) ho sebediswa dibaka tsa thibelo ya XhoI le EcoRI. Sena se netefaditse hore di-clone di ne di le ka hara foreimi ka di-tag tsa C-terminal GFP-FLAG-10xHis le mCherry-FLAG-10xHis, tse kgaolwang ke HRC-3C protease (PPX), e leng se dumellang ho ikemela.tlhahisoLi-primer tse sebelisitsoeng ho kopanya Nanchung le Inactive ho vekthara ea pBacMam e ne e le tse latelang:
Litšoantšo tsa microscopic tsa likaroloana ka bonngoe li fumanoe ho microscope ea phetiso ea motlakase ea Titan Krios G2 (FEI) e nang le khamera ea K3 le sefe sa matla sa Gatan BioQuantum. Microscope e sebelitsoe ho 300 keV, ka tlhophiso ea matla ea 20 eV, boholo ba pixel ea sampole ea 1.08 Å/pixel (magnification ea nominal ea 81,000x), le gradient ea defocus e tlohang ho -0.8 ho isa ho -2.2 μm. Ho rekota video ho entsoe ka liforeimi tse 40 ka motsotsoana ho sebelisoa microscope ea Latitude S (Gatan) ka sekhahla sa tekanyo ea nominal ea 25 e–px−1 s−1, nako ea ho pepesehela ea 2.4 s, le tekanyo eohle ea hoo e ka bang 60 e–Å−2.
Tokiso ea motsamao o susumetsoang ke mahlaseli le boima ba tekanyo li entsoe filiming ho sebelisoa MotionCor2 ho RELION 4.061. Tekanyo ea liparamente tsa mosebetsi oa phetisetso ea phapang (CTF) e entsoe ho cryoSPARC ho sebelisoa mokhoa oa khakanyo ea CTF o thehiloeng ho patch62. Lifotomicrograph tse nang le qeto ea ho lekana ea CTF ≥4 Å li ile tsa tlosoa tlhahlobong e latelang. Ka tloaelo, sehlopha sa lifotomicrograph tse 500–1000 se ile sa sebelisoa bakeng sa khetho ea lintlha ho cryoSPARC, sa lateloa ke mekhahlelo e 'maloa ea karohano ea 2D kamora ho sefa ho fumana setšoantšo se hlakileng sa referense bakeng sa khetho ea likaroloana tse thehiloeng ho template. Likaroloana li ile tsa ntšoa ho sebelisoa mabokose a tlamang a 64-pixel le ho beoa ha 4-fold. Likarolo tse 'maloa tsa karohano ea 2D li entsoe ho tlosa mekhahlelo ea likaroloana tse sa batleheng. Mohlala oa pele oa 3D o ile oa tsosolosoa ho sebelisoa ho tsosolosoa ha ab initio le ho ntlafatsoa ho sebelisoa ntlafatso e sa lekanang ho cryoSPARC. Sehlopha sa 3D se entsoe ho cryoSPARC kapa RELION ho latela ho se tšoane ha ARD. Ha ho ho se tšoane ho hoholo ha libaka tsa membrane ho ileng ha bonoa. Likaroloana li ile tsa hloekisoa ho sebelisoa mekhoa ea C1 le C2; likaroloana tse nang le qeto e phahameng ea C2 li ile tsa nkoa li lekana mabapi le C2 'me tsa kenngoa ka har'a RELION bakeng sa ntlafatso ea Bayesian. Likaroloana li ile tsa fetisetsoa ho cryoSPARC bakeng sa ntlafatso ea ho qetela e seng ea junifomo le ea lehae. Qeto ea ho qetela le palo ea likaroloana li bontšitsoe ho Tafole ea 1.
Ha re ntse re sebetsana le li-pentamer tsa Nan+AP, re ile ra hlahloba mekhoa e fapaneng ea ho ntlafatsa tharollo ea libaka tsa lera (haholo-holo sebaka sa pore), joalo ka ho tlosa matšoao le ho pata TMD. Leha ho le joalo, boiteko bona ha boa ka ba atleha ka lebaka la pherekano e ka bang teng sebakeng sa pore le ho se tšoane ka kakaretso ha TMD. Qeto ea ho qetela e baliloe ho sebelisoa maske e hlahisoang ka bo eona ke mokhoa oa ts'ebetso o sa ts'oanang ho cryoSPARC, haholo-holo e shebaneng le sebaka sa ARD. Sena se fihletse qeto e phahameng haholo ho feta ea libaka tsa lera (haholo-holo sebaka sa VSLD).
Mehlala e metjha ya pele ya dibopeho tsa apo tsa dikokonyana tsa Nanchung le Inactive e hlahisitswe ka lekgetlo la pele ho sebediswa Coot63, mme mehlala ya dikokonyana tsa Nan le Iav e hlahisitswe ho sebediswa AlphaFold264 ho hlwaya dibaka tse se nang tshepo e ngata. Mohlala wa Calmodulin o ne o itshetlehile hodima ho lekana ha mmele o tiileng wa mehlala ya Ca2+-binding le Ca2+-free ho di-accession tsa PDB 4JPZ56 le 1CFD65, ka ho latellana. Mehlala e ntlafaditswe ho sebediswa ntlafatso ya sedikadikwe ho netefatsa stereochemistry e nepahetseng le jiometri e ntle. Phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, le phosphatidylserine di ile tsa etswa mohlala e le bongata ba lipid bo hlalositsweng hantle, mme di-ligand tsa NAM le AP di ile tsa bewa bongata bo tsamaellanang dikopanong tse tiileng. Difaele tsa thibelo di ile tsa hlahisitswe ho tswa ho thapo ya SMILES ya di-isoform ho sebediswa eLBOW ho PHENIX66. Qetellong, mehlala e ntlafaditswe sebakeng sa nnete ho PHENIX ho sebediswa patlo ya gridi ya lehae le phokotso ya lefatshe ka bophara ka dithibelo tsa sebopeho sa bobedi. Seva sa MolProbity se sebediseditswe ho ntlafatsa mohlala le tlhahlobo ya sebopeho, mme ditshwantsho di entswe ho sebediswa PyMOL le UCSF Chimera X. 67,68,69 Tlhahlobo ya lesoba e entswe ho sebediswa seva sa HOLE,70 mme mmapa wa paballo ya tatellano o entswe ho sebediswa seva sa Consurf.71
Tlhahlobo ea lipalo-palo e entsoe ho sebelisoa Igor Pro 6.2, Excel Office 365, le GraphPad Prism 7.0. Lintlha tsohle tsa bongata li hlahisoa e le phoso e tloaelehileng ea ± (SEM). Teko ea t ea seithuti (e nang le mehatla e 'meli, e sa peanngoang) e sebelisitsoe ho bapisa lihlopha tse peli. Tlhahlobo ea phapang ea tsela e le 'ngoe (ANOVA) e lateloang ke teko ea post hoc ea Dunnett e sebelisitsoe ho bapisa lihlopha tse ngata. *P< 0.05, **P< 0.01, le ***PHo feta 0.001 ho ne ho nkuwa e le tsa bohlokwa ka dipalopalo ho latela kabo ya data. Boleng ba Kd, Ki, le dinako tsa bona tsa boitshepo tse sa lekanang tsa 95% di badilwe ho sebediswa GraphPad Prism 10.
Bakeng sa lintlha tse ling mabapi le mokhoa oa ho ithuta, ka kopo sheba Kakaretso ea Tlaleho ea Potefolio ea Tlhaho e hokahantsoeng sehloohong sena.
Mohlala wa pele o hahiloe ho sebediswa mehlala ya calmodulin ho tswa ho di-database tsa PDB 4JPZ le 1CFD. Di-coordinates di kentswe ho Protein Data Bank (PDB) tlasa dinomoro tsa kamohelo 9NVN (Nan-Iav-CaM ntle le ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM e tlamelletsweng ho nicotinamide), 9NVP (Nan-Iav-CaM e tlamelletsweng ho nicotinamide le EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM e tlamelletsweng ho aphenidolpyrrolline le calcium), 9NVR (Nan-Iav-CaM e tlamelletsweng ho aphenidolpyrrolline le EDTA), le 9NVS (Nan pentamer e tlamelletsweng ho aphenidolpyrrolline). Litšoantšo tse tsamaellanang tsa cryo-electron microscopy li kentsoe ho Electron Microscopy Database (EMDB) tlas'a linomoro tse latelang tsa kamohelo: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM ntle le ligand), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM complex e nang le nicotinamide), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM complex e nang le nicotinamide le EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM complex e nang le aphidopyrrolline le calcium), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM complex e nang le aphidopyrrolline le EDTA), le EMD-49849 (Nan pentamer complex e nang le aphidopyrrolline). Lintlha tse tala bakeng sa tlhahlobo ea ts'ebetso li hlahisoa pampiring ena.
Nako ea poso: Pherekhong-28-2026